La reconstrucció de l’anatomia de Denisova 3 a partir del seu metiloma d’ADN

Paleoepigenètica humana: Ja fa més de nou anys que vam comentar la descoberta de Krause et al. que la seqüència completa de l’ADN mitocondrial extret d’una falange humana de la Sibèria de fa 40.000 anys (Denisova 3) no encaixava ni amb les variants descrites pels neandertals ni per les dels homes anatòmicament moderns (que, per mantindre el criteri espeleonímic, designarem com a cromanyons). Hom postulà, doncs, l’existència d’un tercer llinatge, subespècie o espècie, en l’Euràsia Central de l’època: els denisovans. Els llinatges de denisovans i de neandertals convergeixen en un moment situat fa 390-440 milers d’anys. I el llinatge del qual descendeixen denisovans i neandertals convergeix amb els dels ancestres dels cromanyons en un moment un xic anterior, fa 520-630 milers d’anys. Recular tant en el temps significa assumir, pel que fa a neandertals i, especialment, per a cromanyons, canvis substancials en l’anatomia. Però si de cromanyons tenim informació anatòmica precisa (7700 milions d’exemplars vius en l’actualitat, i enormes quantitats de restes antigues), i de neandertals en tenim prou (centenars d’espècimens fòssils, més o menys complets, hi han estat adscrits), no podem dir el mateix dels denisovans, dels quals únicament la falange Denisova 3, n’és testimoni anatòmic. A la mateixa cova de Denisova s’hi han trobat altres espècimens, i l’estiu passat parlàvem de la seqüenciació del genoma de Denisova 11, però en aquest cas es tracta de la filla d’una mare denisovana i d’un pare neandertal (Slon et al., 2018). Sense un coneixement anatòmic dels denisovans és més que probable que, en cas de topar-hi amb més restes, aquestes siguin preses com un possible neandertal si no s’hi pot recuperar ADN antic que ho clarifiqui. El camí contrari seria deduir a partir de l’ADN antic de Denisova 3 la morfologia d’aquest llinatge humà. I això és el que proposen un grup d’investigadors encapçalat per David Gokhman i Liran Carmel, del Departament de Genètica de la Universitat Hebrea de Jerusalem. En un article a la revista Cell, Gokhman et al. reconstrueixen la morfologia esquelètica de Denisova 3 a partir de patrons de metilació del seu ADN. La metilació d’ADN és considerada en aquest sentit com un signe de l’expressió gènica: concretament canvis unidireccionals de metilació s’associarien a fenotips de pèrdua de funció. Gokhman et al. també han experimentat la tècnica sobre neandertals i sobre ximpanzés, aconseguint la identificació de trets divergents entre uns i altres amb una precisió superior al 85%. D’acord amb la reconstrucció dels denisovans que ofereixen Gokhman et al., aquests compartien molts dels trets típics dels neandertals: rostre elongat, pelvis ampla. Ara bé, els denisovans també mostrarien uns trets característics diferencials, com un major arc dental i una major expansió cranial en direcció lateral. Cal dir que aquests trets característics han estat observats en el crani de Xuchang, de 90.000 anys d’antiguitat, i que alguns prèviament havien postulat com a possible denisovà. Més enllà de la qüestió concreta dels denisovans, aquesta tècnica de reconstrucció anatòmica sobre els patrons metilació d’ADN antic podria fer notables aportacions en el camp de la paleontologia general.

La tècnica de Gokhman et al. analitza modificacions en la càrrega de metilació d’ADN antic. Així es poden identificar gens que, per a aquest organisme, han perdut funció. Si a través d’una espècie de referència, es coneixen els efectes fenotípics que té la pèrdua d’aquest gen, és possible inferir característiques de l’organisme portador de l’ADN antic analitzat

De la metilació de l’ADN a la morfologia esquelètica

David Gokhman treballa al Departament de Genètica de l’Institut Alexander Silberman de Ciències de la Vida, centre adscrit a la Facultat de Ciències de la Universitat Hebrea de Jerusalem, situat al Campus Edmond J. Safra de Givat Ram. Gokhman és qui concebé la idea d’aquesta recerca, i qui conduí totes les anàlisis.

Nadav Mishol és membre del mateix departament, i recollí dades per a les anàlisis per a l’estudi d’associació de genoma complet.

Les dades per a les anàlisis no-sinònimes foren aportades per Marc de Manuel, David Juan i Tomàs Marquès-Bonet. Tots tres són membres del Laboratori de Genòmica Comparada de l’Institut de Biologia Evolutiva, centre adscrit a la Universitat Pompeu Fabra i al CSIC, i que té la seu al Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona. Marquès-Bonet és, a més, membre d’ICREA, del Centre Nacional d’Anàlisis Genòmiques (CNAG) del Centre de Regulació Genòmica (CRG) del Barcelona Institute of Science and Technology (BIST) i de l’Institut Català de Paleontologia Miquel Crusafont (UAB).

Jonathan Shuqrun anotà fenotips. Shuqrun és membre del Departament de Genètica de la UHJ i pertany al Programa Alpha (l’equivalent al nostre ICREA).

El professor Yoel Rak supervisà les comparacions amb trets coneguts de neandertals i de ximpanzés. Rak, nascut el 1946, és membre del Departament d’Anatomia i Antropologia de la Facultat Sackler de Medicina de la Universitat de Tel Aviv.

El professor Eran Meshorer participà en la supervisió de la generació de dades de metilació de l’ADN de Denisova 3. El laboratori d’epigenètica de Meshorer fa part del Departament de Genètica de la UHJ i alhora és adscrit al The Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC).

Liran Carmel és membre del Departament de Genètica de la UHJ. Al costat de Gokhman, dissenyà l’estudi.

El finançament de l’estudi es realitzà amb el projecte que Carmel té amb la National Geographic Society (HJ-111R-17). Carmel supervisà la recerca. Gokhman té el suport de la Clore Israel Foundation. Marquès-Bonet té el suport del Ministerio de Economía y Empresa de España (amb el projecte BFU2017-86471-P, de fons FEDER de la UE), una beca Howard Hughes International Early Career (U01 MH106874), ajut de l’Obra Social “La Caixa”, i de la Secretaria d’Universitats i Recerca de la Generalitat de Catalunya (GRC 2017 SGR 880). Els autors agraeixen el suport tècnic de Shiran Bar, David Reich, Iain Mathieson, Chris Stringer i del Fraser Lab. Les il·lustracions que acompanyen aquesta recerca són obra de Maayan Harel.

Gokhman i Carmel redacten l’article, que trameteren a la revista Cell el 7 de març del 2019. El text fou revisat, i retramès el 24 de maig, aquesta vegada per ésser acceptat el 20 d’agost, i publicat el 19 de setembre.

La informació paleontològica sobre l’anatomia dels denisovans és escassa pel caràcter fragmentari de les restes òssies de les quals es recuperà l’ADN que serví en el 2010 per a la descripció d’aquest grup humà. El nom de denisova fa referència a Denisova 3, un dels espècimens (consistent en una falange humana) trobats en la cova homònima (Дени́сова Пеще́ра) a les muntanyes d’Altai. Denisova 3 ha estat datat amb una antiguitat de 74-82 milers d’anys. Bona part del que sabem dels denisovans es dedueix de l’ADN extret d’aquesta falange. Els ancestres dels denisovans i els ancestres dels neandertals tenen l’ancestre comú més recent en una data reculada: 390-440 milers d’anys. Més reculada encara és la data de l’ancestre comú més recent compartit per cromanyons i neandertals-denisovans: 520 i 630 milers d’anys. Ara bé, aquestes separacions de llinatges no obsten per l’existència de creuaments posteriors. Tant és així, que hom ha descrit en poblacions humanes actuals una ascendència denisovana, que arriba fins al 6% en el cas dels melanesis i dels australians aborígens. Algunes seqüències genètiques originàries dels denisovans s’han vist seleccionades positivament en poblacions humanes modernes exposades a climes freds o d’alta muntanya.

La Cova Deníssova o Аю-Таш

De manera temptativa s’han adscrit a denisovans altres restes fragmentàries: una mandíbula inferior i diverses dents. D’aquestes restes es dedueix que els molars dels denisovans presenten característiques diferencials de neandertals i de cromanyons en les corones i en les arrels, així com en la mida. La mandíbula atribuïda a un denisovà és robusta, prominent, amb llarga arcada dental i sense barbeta, és a dir més de l’estil dels neandertals.

Hom disposa de la seqüència genòmica de Denisova 3. De la comparació d’aquest genoma amb el dels humans moderns en resulten 30.000 canvis fixats, dels quals tan sols 100 consisteixen en substitucions que alteren la seqüència de proteïnes. Els estudis d’associació genòmica basats en els humans moderns són de difícil translació als denisovans. És per això que Gokhman et al. preferiren un enfocament basat en l’expressió gènica més que no pas en la seqüència genètica. Ara bé, l’expressió gènica no es pot seguir directament a partir de l’ARN antic, ja que aquest no s’hi conserva tan bé com l’ADN. Sí que es pot seguir, en canvi, a través de la metilació de l’ADN, que és un element de regulació que juga un paper en l’expressió gènica. L’estudi del “metiloma” (les alteracions en la metilació del genoma) seria una forma indirecta d’estudiar el “transcriptoma” (els transcrits d’ARN fets a partir de l’ADN genòmic).

Es tracta, doncs, de comparar els patrons de metilació de l’ADN de Denisova 3 amb els de neandertals, cromanyons i ximpanzés, per tal d’identificar alteracions en la funcionalitat de gens entre aquests quatre llinatges. Concretament, Gokhman et al. volien identificar gens que haguessin perdut funció en el llinatge dels denisovans. Una vegada identificats aquests gens, calia estudiar en les bases de dades sobre humans moderns les conseqüències de la pèrdua de funció de cadascun d’ells. La precisió d’aquesta metodologia era paral·lelament comprovada en aplicar-la a neandertals i ximpanzés.

La reconstrucció del metiloma a partir de l’ADN antic

La seqüència d’ADN consisteix en la sèrie alternativa de bases en cada posició nucleotídica: guanines (G), citosines (C), timines (T) i adenines (A). La metilació d’ADN té lloc principalment en les citosines, donant lloc a metilcitosines (mC), i particularment en citosines que són seguides de guanines (CpG). Les metilcitosines es poden deduir en l’ADN antic pels patrons de dany en la molècula. El grup de recerca de Gokhman ha desenvolupat un mètode per reconstruir el metiloma d’ADN antic, i l’ha aplicat en Denisova 3, en dos neandertals (d’Altai i de Vindija) i en cinc cromanyons (de 45.000 a 7.500 anys d’antiguitat). En comparar aquests metilomes reconstruïts amb els metilomes d’os d’espècimens actuals d’humans (55 individus) i de ximpanzés (5 individus), el grup de Gokhman ha identificat les regions amb metilacions diferencials segons cadascun d’aquests llinatges d’hominins.

L’existència de metilació diferencial, però, no depèn exclusivament del llinatge. Altres factors, com l’edat o el sexe, hi poden participar. A més, poden haver-hi diferències segons els tipus d’os analitzat. En tot cas, Gokhman et al. se centren en les diferències per llinatge, i assumeixen que aquestes diferències reflecteixen canvis en els nivells d’activitat gènica, i que variacions en l’activitat gènica tenen un impacte fenotípic en la morfologia. Per fer-ho, van haver de descartar tots aquells gens que mostressin diferències de metilació en humans moderns pel que fa al tipus d’os, a l’edat, l’estat de salut o el sexe. Restringiren la seva anàlisi a metilacions diferencials que suposessin, si més no, un 50% de canvi entre llinatges, i que abastessin regions no pas menors a 50 posicions CpG.

Amb aquestes restriccions resulten 873 regions de metilació diferencial per als homes moderns, 939 per als homes arcaics (els ancestres comuns de neandertals i denisovans), 570 per als neandertals, 443 per als denisovans i 2031 per als ximpanzés.

Però quin efecte té la metilació en una seqüència genòmica? En general, la metilació de promotors de gens condueix a un silenciament de l’expressió d’aquest gen. És per això que Gokhman et al. es fixen únicament en les regions de metilació diferencial que afecten promotors de gens (entre 5 i 1 kb abans de l’inici de transcripció). Això redueix la llista a 154 regions d’humans moderns, 171 d’humans arcaics, 113 de neandertals, 55 de denisovans i 415 de ximpanzés. D’acord amb les bases de dades de Roadmap Epigenomics i de GTEx, la hipermetilació en aquestes regions produeix amb més d’un 90% de correlació un silenciament gènic. Val a dir, però, que Gokhman et al. també anoten l’especificitat de 5 regions en les que hi hauria una sobreexpressió associada a la hipermetilació.

Amb aquestes condicions, Gokhman et al. defineixen un seguit de gens diferencialment metilats entre els llinatges estudiats. D’acord amb la base de dades HPO, dedueixen l’efecte del silenciament de cadascun d’aquests gens. HPO es basa en els símptomes de 4000 trastorns humans monogènics.

D’aquesta manera, es dedueixen fenotips diferencials entre els llinatges. En alguns casos es tracta de fenotips direccionals, és a dir que varien en un eix unidimensional. Gokhman et al. se centren en aquests fenotips (uns 815 en la base de dades de HPO per a característiques esquelètiques), i descarten els fenotips no-direccionals, que són d’una natura més complexa.

La reconstrucció anatòmica basada en la metilació: el cas de neandertals i ximpanzés

Gokhman et al. comproven la seva estratègia en neandertals i ximpanzés. Com que d’aquests grups hi ha dades epigenètiques i anatòmiques, la prova serveix per valorar la precisió i la sensibilitat de la tècnica.

En els neandertals, amb aquesta tècnica prediuen 64 trets esquelètics diferencials respecte dels cromanyons. Les comparen amb 107 diferències esquelètiques conegudes, de les quals hi ha 75 que tenen un fenotip a la base de dades HPO. De les 64 prediccions, n’hi ha 53 que encerten (precisió sobre divergència del 82,8%). D’aquestes 53 trets, n’hi ha 33 que són unidireccionals, i el mètode encerta la direccionalitat en 39 d’ells (precisió sobre direccionalitat del 87,9%). Dels 75 trets divergents existents, el mètode identifica 62 (sensibilitat sobre divergència del 82,7%), i dels 46 trets divergents unidireccionals, el mètode identifica la direccionalitat correctament en 36 (sensibilitat sobre direccionalitat del 78,3%).

En els ximpanzés, el mètode prediu 42 trets que difereixen respecte dels humans moderns. D’aquests 42 trets, 38 coincideixen amb les dades anatòmiques (precisió de divergència del 90,5%). Dels 22 trets predits amb direccionalitat, 20 coincideixen amb les dades anatòmiques (precisió de direcció del 90,9%). La sensibilitat de divergència és del 61,4%, i la de direccionalitat de 71,9%.

La reconstrucció de l’anatomia dels denisovans

Gokhman et al. distingeixen entre els trets divergents entre denisovans i neandertals, d’una banda, i cromanyons, de l’altra, i els trets divergents que separen denisovan de neandertals. En total, identifiquen 56 trets en els que Denisova 3 difereix de cromanyons o de neandertals. D’aquests 56 trets, n’hi ha 32 unidireccionals. D’aquests 32 trets unidireccionals, 21 són compartits amb els neandertals: mandíbules robustes, crani baix, augment del creixement de la base cranial, front baix, esmalt dentari gruixut, pelvis àmplia, grans articulacions femorals, puntes amples dels dits, gran caixa toràcica.

Els altres 11 trets mostren divergències unidireccionals entre neandertals i denisovans. Els denisovans, en aquest sentit, presenten un arc dental elongat, un còndil mandibular allargat i expansió biparietal (augment de la distància entre els ossos parietals del crani). Els neandertals, d’altra banda, se separen alhora de denisovans i cromanyons en: ossos temporals del crani més amples en relació a la mandíbula anterior, pèrdua prematura de la dentició permanent.

Gokhman et al. examinen quatre prediccions que fan de la regió mandibular dels denisovans: 1) mandíbula anterior alta; 2) mandíbula anterior àmplia; 3) protrusió manibular; 3) arc dentral llarg. Aquestes prediccions coincideixen en part amb els tres l’única mandíbula atribuïda als denisovans mitjançant anàlisi genètica.

Els denisovans: origen i destí

Ja des de la seva descoberta, hom intuïa que els denisovans podrien haver estat un grup autòcton de l’Euràsia Oriental eventualment desplaçat, primer en part pels neandertals, i després ja pels cromanyons. La reconstrucció de Gokhman et al. coincideix força amb els trets descrits de fòssils xinesos del Pleistocè mitjà i tardà. La classificació d’aquests fòssils és difícil, però alguns d’ells, com el crani de Xuchang (de 100.000 a 130.000 anys d’antiguitat), tenen característiques properes als neandertals. Sense una anàlisi d’ADN antic és encara impossible d’assignar algunes d’aquestes restes als denisovans.

Disposar d’ADN antic denisovà d’altres individus ajudaria a fer més robusta la caracterització genètica i epigenètica d’aquest grup. Alhora, més restes identificades positivament amb denisovans completarien de manera més concloent les característiques anatòmiques, i esclaririen millor la classificació de les restes humanes de l’Àsia Oriental de fa 100.000-50.000 anys que ara romanen en l’aire. És clar que una descripció més precisa d’aquestes poblacions humanes arcaiques, farà aparèixer altres grups i subgrups humans que caldrà classificar al seu torn com ara es comença a fer amb els denisovans.

Lligams:

Reconstructing Denisovan Anatomy Using DNA Methylation Maps. David Gokhman, Nadav Mishol, Marc de Manuel, David de Juan, Jonathan Shuqrun, Eran Meshorer, Tomas Marques-Bonet, Yoel Rak, Liran Carmel. Cell 179: 180-192 (2019)

Aquesta entrada ha esta publicada en 5. La Intel·ligència. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

Aquest lloc utilitza Akismet per reduir el correu brossa. Aprendre com la informació del vostre comentari és processada