Un biomarcador universal del càncer basat en la solvatació i en l’afinitat per l’or de l’ADN

La biologia cel·lular del càncer ha permès durant dècades de recerca d’explicar el procés de transformació tumoral que converteix cèl·lules normals de teixits en cèl·lules canceroses. Malgrat la immensa diversitat de tipus de tumors, hi ha quelcom de comú a tots ells. El grup de recerca de Matt Trau, del Australians Institute for Bioengineering and Nanotechnology de la University of Queensland explora aquesta base comuna per tal de trobar biomarcadors universals del càncer. Trau, juntament amb Abu Ali Ibn Sina i Laura G. Carrascosa, s’ha fixat en la reprogramació epigenètica, particularment pel que fa a la metilació de l’ADN genòmic. La transformació tumoral s’acompanya la majoria de vegades en una alteració d’allò que aquests investigadors anomenen “Methylscape”, és a dir el paisatge de metilacions al llarg del genoma cel·lular. En els genomes tumorals hi ha una metilació agregada en regions reguladores separades per grans passatges intergènics hipometilats. La idea d’Ibn Sina, Carrascosa i Trau és que un canvi tan consistent ha de tindre un impacte en la propietats físico-químiques de l’ADN. S’han fixat particularment en l’efecte dels nivells de metilcitosina i de la seva distribució genòmica en un seguit de propietats físiques i químiques de l’ADN. En un article a Nature Communications expliquen que una alteració en la distribució genòmica de metilcitosina afecten el comportament polimèric de l’ADN, i que això es manifesta en canvis en la solvatació de l’ADN i en l’afinitat de l’ADN per l’or. Així doncs, troben que és possible emprar aquestes dues propietats per diferenciar entre genomes normals i genomes cancerosos. Ibn Sina et al. han desenvolupat a partir d’aquest coneixement assaigs electroquímics o colorimètrics relativament senzills, altament sensibles i selectius, per a la detecció del càncer. Són assaigs ràpids, enllestits en menys de 10 minuts, amb un requeriment mínim de mostra i sense una complexa preparació. Ara, doncs, caldrà demostrar l’aplicabilitat clínica d’aquests assaigs com a eina diagnòstica.

La transformació tumoral implica una alteració en els patrons de metilació de l’ADN. Així, en els genomes tumorals, les metilcitosines es concentren en regions reguladors riques en CpG (la citosina seguida de guanina en la seqüència nucleotídica). Els canvis són prou pronunciats com perquè l’ADN tumoral es diferenciï també en termes de solvatació i, en conseqüència, en l’absorció a superfícies d’or: l’ADN normal tendeix més fàcilment a formar agregats i té una major absorció a l’or en comparació amb l’ADN tumoral

Biomarcador universal del càncer

Aquest projecte fou concebut per Abu Ali Ibn Sina, Laura G. Carrascosa i Matt Trau, del Center for Personalized Nanomedicine, de l’Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology (AIBN) de The University of Queenslands, a Brisbane. Els experiments foren dissenyats per Carrascosa i Ibn Sina, amb l’ajut de Trau. L’extracció d’ADN de mostres de pacients les van dur a terme Darren Korbie (també de l’AIBN) i Ibn Sina. Muhammad J. A. Shiddiky (també de l’AIBN) ajudà en el disseny dels experiments electroquímics. Els experiments els dugueren a terme Ibn Sina, Carrascosa, Ziyu Liang i Andri Wardiana, tots quatre de l’AIBN. Yadveer S. Grewal prengué les imatges de microscopia electrònica de transmissió i de microscopia de força atòmica. Robert A. Gardiner i Hemamali Samaratunga, de la School of Medicine de la University of Queensland forní mostres de càncer de pròstata. Maher K. Gandhi, del Diamantina Institute, de la University of Queensland aportà mostres de limfoma. Rodney J. Scott, de la School of Biomedical Science and Pharmacy, de The University of Newcastle, a Callaghan (Nova Gal·les del Sud) forní mostres de càncer colorectal. Carrascosa i Ibn Sina redactaren l’article amb aportacions dels altres autors.

Aquesta recerca es finança amb el projecte postdoctoral de la UQ de Carrascosa, i el projecte de la National Breast Cancer Foundation of Australia de Trau. Els autors agraeixen a Peter Schmid i Alice Shia per la donació de mostres de l’assaig clínic UK-Forever. En la preparació de mostres participaren els estudiants de màster Ting-Yun Lin, Adithi Dinesh Nambiar i Yefei Liang.

Quan parlem d’epigenètica pensem d’entrada en la metilació d’ADN, és a dir en l’addició d’un grup metil als nucleòtids de citosina (C). La presència de metilcitosines en l’ADN no modifica la seqüència gènica, però sí la interacció de l’ADN amb els proteïnes que participaren en el control i programació genètiques. El patró de metilació de citosina és un dels elements definidor de l’estat epigenètic de la cèl·lula i varia per a cada tipus cel·lular.

En les cèl·lules tumorals hi ha una reprogramació epigenètica. En termes globals es redueix la metilació de l’ADN. Al mateix temps, aquesta metilació augmenta en regions riques en CpG, que habitualment són regions reguladores, com per exemple promotors de gens.

La reprogramació epigenètica de les cèl·lules tumorals i, particularment, els nivells de metilcitosina, constitueixen un àrea d’intensa recerca en la biologia molecular del càncer. Ibn Sina et al., però, s’interessen específicament en com aquesta alteració en la metilació té un impacte en les propietats bàsiques de l’ADN i, fins a quin punt, es poden aprofitar per desenvolupar eines diagnòstiques.

La metilació de l’ADN afecta l’estructura i la flexibilitat de la molècula i, de retruc, la conformació tridimensional. Això s’explica, en part, perquè les metilcitosines són més hidròfobes i tenen un pes molecular superior respecte de les citosines. D’aquesta manera, Ibn Sina et al. han trobat que l’ADN genòmic de cèl·lules normals tendeix més fàcilment a l’agregació en solucions aquoses.

Diferències d’agregació entre epigenomes normals i epigenomes cancerosos

Ibn Sina et al. comparen mostres de pròstata normal i de pròstata cancerosa. A través de la microscopia electrònica de transmissió examinen l’ADN genòmic extret d’aquestes mostres. Mentre l’ADN cancerós recobreix uniformement la superfície de la preparació, l’ADN normal forma grans agregats. L’anàlisi digital de les imatges mostra que la mida típica d’un agregat d’ADN normal és de 8300 nm2, mentre que el d’ADN tumoral és de 1540 nm2.

També comparen les propietats d’agregació de tres epigenomes comparables:
– l’epigenoma de la línia cel·lular tumoral de càncer de mama BT474, que té un nivell de metilació del 43%.
– un epigenoma desmetilat de BT474, a través de l’amplificació hologenòmica.
– un epigenoma M-Jurkat que ha estat metilat al 100% amb una tècnica enzimàtica que garanteix la metilació de tots els llocs CpG.

En aquests tres casos també es manifesta per microscopia electrònica de transmissió que una major metilació global comporta una major agregació. Això s’explicaria per una major hidrofobicitat.

L’absorció de l’ADN a una superfície d’or

Els tres epigenomes esmentats han estat estudiats també pel que fa a l’absorció a substrats ultraplans d’or. En aquest cas, la visualització de la interacció es fa amb microscopia de força atòmica. Ibn Sina et al. comproven que els nivells d’absorció són dependents del nivell de metilació, però d’una manera una mica complexa. Així, l’ADN sense metilar s’absorbeix poc, però també és baixa l’adhesió de l’ADN metilat al 100%; els nivells d’absorció són superiors en la metilació intermèdia.

Els nivells d’absorció de l’ADN a superfícies d’or també són mesurats electroquímicament. En aquest cas, s’utilitzen electrodes d’or, exposats a 5 µL d’ADN purificat (a una concentració de 10 ng/µL). L’absorció es fa en un sistema redox [Fe(CN)6]3-/4-, de manera que el voltatge és superior com menys absorció d’ADN hi hagi en l’electrode.

Per aquest estudi electroquímic, Ibn Sina et al. empren una col·lecció d’ADN genòmics que classifiquen en cinc grups: 1) sense metilació; 2) hipometilats (generats per exposició a 5-azacitidina); 3) de metilació moderada; 4) d’elevada metilació CpG; 5) metilació al 100% en CpG. Troben precisament, que la major absorció es troba en genomes amb nivells de metilació típics de cèl·lules tumorals.

Cap a un mètode simple de detecció de càncer

A partir de l’assaig electroquímic, Ibn Sina et al. exploren diverses línies tumorals de càncer de mama (BT474, MCF7, T47D), pròstata (LNCap), pulmó (H1975) i colorectal (HCT116), així com cèl·lules normals de mama (HMEC) o de pròstata (PrEC). Troben que els genomes de cèl·lules tumorals generen corrents en aquest sistema electroquímic 2,5 vegades superiors al de cèl·lules normals.

La diferència en absorció d’or, explicable per la diferència en el patró de metilació, permet discriminar en un assaig electroquímic entre l’ADN de cèl·lules tumorals i el de cèl·lules normals

Seguidament, Ibn Sina et al. analitzaren amb el seu mètode electroquímic 72 epigenomes procedents de teixits tumorals de pacients (54 de càncer de mama ER+, 8 de pròstata i 10 de limfoma). Els compararen amb 31 epigenomes de teixits normals (19 de mama, 10 de pròstata i 2 de ganglis limfàtics). Obtingueren una precisió del mètode del 89,32%.

La detecció electroquímica d’ADN tumoral en el plasma

Ibn Sina et al. passaren després a comparar mostres de plasma de 100 pacients tumorals (de càncer de mama o colorectal) amb plasma de 45 individus sans. Per a l’anàlisi en tenien prou amb 5 pg d’ADN lliure circulant (cfDNA) extret del plasma. L’assaig es realitzava en 10 minuts. La tècnica els permetia discriminar entre el plasma de pacients tumorals i d’individus sans, amb una precisió del 83,45%.

Un mètode colorimètric discernible a ull nu

Per desenvolupar un mètode colorimètric a partir de les mateixes bases, Ibn Sina et al. utilitzen un sistema d’agregació AuNP. En aquest cas es tracta d’analitzar l’absorció de l’ADN a or col·loidal. La tècnica visualitza pel fet que l’ADN unit a les partícules d’or col·loidal impedeix la formació ulterior d’agregats d’AuNP quan s’hi afegeixen sals. L’agregació d’AuNP és visible com un canvi de color de la solució, que passa del roig al blau.

Aquesta tècnica requereix 50 ng d’ADN purificat, que és incubat amb AuNPs durant 5 minuts. Tot seguit s’hi afegeix una sal. La reacció es monitoritza amb un colorímetre (A658/520).

La tècnica no es tan precisa com l’electroquímica (77,08% de precisió) però és més senzilla. La quantitat de mostra necessària per fer una anàlisi de plasma és la mateixa.

El biomarcador Methylscape

Ibn Sina et al. han estudiat amb detall les bases bioquímiques d’aquest “Methylscape”. Tant el mètode electroquímic (electrode d’or) com el colorimètric (sistema d’or col·loidal) detecten patrons de metilació de l’ADN. La tècnica es pot aplicar tant a ADN extret de biòpsies com de sang perifèrica (mostres de plasma).

Queda endavant, però, tot un desenvolupament fins a aconseguir un mètode d’assaig que sigui clínicament rellevant. Si prospera, el mètode es trobaria en la primera línia diagnòstica davant de símptomes atribuïbles a una neoplàsia amb una anàlisi de sang.

Lligams:

Epigenetically reprogrammed methylation landscape drives the DNA self-assembly and serves as a universal cancer biomarker. Abu Ali Ibn Sina, Laura G. Carrascosa, Ziyu Liang, Yadveer S. Grewal, Andri Wardiana, Muhammad J. A. Shiddiky, Robert A. Gardiner, Hemamali Smaratunga, Maher K. Gandhi, Rodney J. Scott, Darren Korbie, Matt Trau. Nature Communications 9: 4915 (2018).

Aquesta entrada ha esta publicada en 6. La Civilització. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

Aquest lloc utilitza Akismet per reduir el correu brossa. Aprendre com la informació del vostre comentari és processada