La neutralització de la citocina LIF i la inhibició del PD1 en la immunoteràpia anti-tumoral

El passat més d’octubre comentàvem la concessió del Premi Nobel de Medicina a James P. Allison i Tasuku Honjo “per la descoberta de teràpia del càncer a través de la inhibició de la regulació negativa immune”. La regulació negativa immune és essencial per mantindre el balanç entre la resposta d’atac i la resposta de tolerància del sistema immunitari. Però aquesta regulativa negativa pot constituir un fre en la resposta del sistema immunitari a tumors, i en conseqüència és una diana d’interès per a estratègies terapèutiques antitumorals. La immunoteràpia antitumoral, a nivell cel·lular, ha de promoure la infiltració de limfòcits citotòxics (cèl·lules T CD8+) dins del tumor, alhora que s’hi manté la presència de macròfags associats a les cèl·lules tumorals. El grup de recerca de Joan Seoane de l’Institut d’Oncologia de la Vall d’Hebron (VHIO) treballa en els determinants moleculars i cel·lulars de la infiltració intratumoral de limfòcits T citotòxics i de macròfags associats a tumors. En un article a Nature Communications, el grup de Seoane mostra com la citocina LIF té un paper crucial en la inhibició de la infiltració dels limfòcits i que també promou la presència de macròfags protumorals. En alguns tumors hom troba nivells elevats de LIF, i Pascual-García et al. troben que en aquests casos, el bloqueig de LIF indueix canvis en els macròfags associats a tumors, amb disminució de marcadors com CD206, CD163 i CCL2, i augment de la quimiocina CXCL9. LIF produeix un silenciament epigenètic del gen CXCL9, i la inhibició de LIF té com a efecte l’augment d’aquesta quimiocina, la qual estimular la infiltració de limfòcits T CD8+. Els autors d’aquest estudi conclouen que la combinació de la inhibició del sistema PD1 (el sistema que identificà Tasuku Honjo el 1992) amb anticossos neutralitzants de LIF promou la regressió tumoral i la memòria immunològica.

El bloqueig de LIF disminueix el creixement tumoral i promou la infiltració de cèl·lules del sistema immunitari. Pascual-García et al. han estudiat els nivell d’expressió de LIF en 28 tipus de tumors sòlids (a), i han constatat la relació entre aquesta expressió i la presència de macròfags protumorals (b). En un model de ratolí han assajat l’impacte del bloqueig de LIF sobre els tumors que sobreexpressen aquesta citocina

LIF com a diana antitumoral

Les primeres autores d’aquest estudi són Mónica Pascual-García i Ester Bonfill-Teixidor. Totes dues formen part del Grup d’expressió gènica i càncer de l’Institut d’Oncologia de l’Hospital Vall d’Hebron, de Barcelona.

L’estudi fou dissenyat per Joan Seoane, cap del Grup. En la generació de dades i el desenvolupament metodològic participaren Pascual-García, Bonfill-Teixidor, Ester Planas-Rigol, Carlota Rubio-Perez, Raffaella Iurlaro, Alexandra Arias, Isabel Cuartas, Ada Sala-Hojman, Laura Escudero, Isabel Huber-Ruano, Paolo Nuciforo, Leire Pedrosa, Carolina Marques, Massimo Squatrito i Carmen Espejo. La majoria són membres també del VHIO, excepte Pedrosa, que és de l’IDIBAPS, Marques i Squatrito, que són del Grup de Tumors Cerebrals de la Fundación Seve Ballesteros del CNIO, i Espejo, que és de la Universitat Autònoma.

En la recerca també participaren Irene Braña, Elena Garralda, María Vieto i Josep Tabernero (del VHIO), així com Estela Pineda i Francesc Graus (de l’IDIBAPS).

Seoane interpretà les dades i redactà l’article amb l’ajut d’altres autors.

El grup de recerca de Seoane és un grup de recerca translacional. Això vol dir que els objectes d’estudi poden traslladar-se de forma força directa a la pràctica. En aquest sentit, Seoane és co-fundador de Mosaic Biomedicals i accionista de Northern Biologics. Aquestes dues companyies, a més de Roche/Glycart, han finançat recerques de Seoane. D’altra banda, Tabernero ha fet tasques de consultoria per tot un ventall de companyies farmacèutiques, com també ho ha fet Pineda per a Celgene. Garralda ha rebut finançament de Novartis per a la seva recerca, i també ha fet tasques de consultoria. Declaracions semblants fan Braña o Nuciforo.

En aquesta recerca concreta, s’han fet servir fons procedents del projecte ERC 205819 sobre els mecanismes moleculars de la gènesi i progressió del glioma (del Consell de Recerca Europeu), del projecte PI16/01278 (d’identificació de mecanismes de resistència a tractament a través de l’estudi de l’evolució de l’heterogeneïtat intra-tumoral en el glioblastoma) del Instituto de Salud Carlos III, i el projecte RTC-2015-3771-1 de desenvolupament d’un fàrmac innovador i personalitzat per al tractament del càncer a través de la reactivació del sistema immune.

Els autors agraeixen la col·laboració dels departaments d’oncologia mèdica, neurocirurgia i patologia de l’Hospital de la Vall d’Hebron i de l’Hospital Clínic, així com el suport tècnic de Cristina Sánchez.

L’article fou tramès a Nature Communications el passat 28 de març, i fou acceptat el 8 de maig.

L’acrònim LIF vol dir “factor inhibitori de la leucèmia”. El gen LIF també rep els noms de factor de diferenciació colinèrgic i de factor D. El producte del gen LIF és una citocina, és a dir una proteïna de secreció que participa en processos de comunicació intercel·lular. Malgrat el prometedor nom, cal dir que LIF realitza diferents funcions en diferents moments del desenvolupament ontogènic i en diferents sistemes. Participa en el desenvolupament embrionari, on inhibeix la diferenciació de les cèl·lules totipotencials. Té un rol crucial en la implantació del blastocist a la paret de la matriu, ja que és gràcies al LIF que es desenvolupa un microambient immunosupressor sense el qual el sistema immunitari matern podria arribar a rebutjar l’embrió.

Encara que LIF fou descrit originàriament com un factor antioncogènic (concretament, contra leucèmies), pot actuar també com a factor oncogènic. D’una banda, LIF afavoreix la renovació de les cèl·lules iniciadores de tumors de manera anàloga a com ho fa en l’embrió amb les cèl·lules totipotencials. També actua a través dels fibroblasts associats a tumors (dels quals hem parlat en alguna ocasió). El LIF també promou la resistència tumoral a radiacions i a substàncies citotòxiques.

És cert que hi ha tumors que no expressen LIF, però altres ho fan, i ho fan a nivells molt elevats. En certs tipus tumorals (càncer de pulmó, càncer de mama, càncer colorectal, càncer naso-faringi) hi ha una associació negativa entre l’expressió d’alts nivells de LIF i la taxa de supervivència.

La recerca de Pascual-García i Bonfill-Teixidor ajuda a entendre les bases moleculars i cel·lulars del rol pro-oncogènic de LIF. L’expressió de LIF s’associa amb una infiltració de macròfags associats a tumors (que, com els fibroblasts associats a tumors, tenen una acció protector o promotora del tumor). La presència de LIF altera l’expressió de marcadors d’aquests macròfags (CD163, CD206) i també la secreció de quimiocines (CXCL9, CCL2). Pascual-García et al. es fixen especialment en el fet que LIF provoca en els macròfags associats a tumors un silenciament epigenètic de CXCL9 (a través del recrutament de EZH2 en el promotor d’aquest gen).

El bloqueig de LIF en tumors mitjançant anticossos trenca la repressió de CXCL9 en els macròfags associats a tumors. La secreció resultant de CXCL9 per part dels macròfags atrau al tumor cèl·lules T CD8+ citotòxiques. La combinació del bloqueig de LIF amb el bloqueig de la vida PD-1 afavoreix la infiltració d’aquestes cèl·lules citotòxiques en el tumor i, en un model de ratolí, Pascual-García han comprovat que això indueix una regressió tumoral, memòria immune específica contra el tumor i un augment de la supervivència general.

Dels pacients del glioblastoma al model de ratolí

El VHIO forma part de l’Hospital del Vall d’Hebron de la mateixa manera que l’IDIBAPS s’associa a l’Hospital Clínic. A través d’aquests dos hospitals s’obtingué el consentiment informat de pacients de glioblastoma als qui s’havia de realitzar biòpsies, així com extreure mostres de sang. El consentiment informat implicava destinar els espècimens obtinguts a la recerca bàsica.

Les mostres de tumor així obtingudes eren processades en el laboratori dins dels primers 30 minuts. El processament incloïa l’esmicolament, la digestió amb col·lagenasa I i DNasa I. S’aconseguia així una suspensió cel·lular, que era traspassada a un medi de cultiu, on s’hi generaven tumoroids.

En els experiments amb tumoroids s’utilitzaren anticossos específics contra LIF (anti-LIF), contra CXCL9 (l’anticòs monoclonal MAB392).

En els experiments d’infiltració s’utilitzaren cèl·lules mononuclears perifèriques obtingudes de la sang del mateix pacient.

Els experiments amb ratolins es feren sobre femelles C57BL/6 i NOD/SCID. Alguns experiments es feien en ratolins modificats genèticament (RAG-/-, CCL2-/-, CXCL9-/-).

Els models de tumor cerebral en ratolí es feien a través de la inoculació de línies tumorals (GL261N, GL261, RCAS) marcades amb luciferasa en el cos estriat de l’hemisferi dret del cervell de ratolins de 8 setmanes. Als ratolins se’ls administrava intraperitonealment dues vegades per setmana bé un anticòs anti-LIF o un control IgG. També hi havia ratolins que rebien altres anticossos (anti-PD1, anti-CCL2 o anti-CXCL9). La progressió tumoral se seguia a través del pes corporal, del diàmetre abdominal i de la mesura de la bioluminescència. Quan els ratolins mostraven signes clínics (caquèxia, anorèxia o elevació de la taxa respiratòria) o pèrdua de les funcions corporals normals, eren sacrificats.

Altres ratolins eren la font de macròfags derivats del moll de l’os (BMDM). També s’extragueren macròfags de les biòpsies de glioblastoma, isolats a través del marcador CD11b.

La correlació entre l’expressió de LIF i la presència de macròfags associats a tumors

L’Atles del Genoma del Càncer (TCGA) abasta 33 tipus diferents de tumors. Pascual-García investigaren les dades del TCGA sobre la correlació entre els nivells d’expressió de LIF i la presència de macròfags associats a tumors (TAMs). La major correlació es troba en el glioblastoma, l’adenocarcinoma de pròstata, el càncer de tiroides i el càncer d’ovari.

El glioblastoma (GBM) és el focus d’atenció del grup de Seoane. En els tumors de GBM s’observa un ample rang de variació dels nivells de LIF. En aquests nivells de LIF hi contribueixen tant les pròpies cèl·lules tumorals (que deriven de la glia, és a dir del teixit de suport de les neurones) com les cèl·lules immunitàries infiltrades en el tumor (bàsicament, macròfags).

El bloqueig de LIF indueix una resposta immune antitumoral

Pascual-García et al. han utilitzat models de ratolí de glioblastoma i de càncer d’ovari per analitzar el paper immunomodulador de LIF. Concretament, han fet servir la línia tumoral GL261N de glioblastoma i la línia tumoral ID8 de càncer d’ovari. Aquestes línies generen tumors que expressen nivells elevats de LIF.

Per reprimir la funció de LIF en aquests tumors, Pascual García et al. empren dues tècniques diferents:
– l’ús d’anticossos neutralitzants contra la proteïna LIF.
– l’ús del sistema CRISPR/CAS9 per interferir l’ARN del gen LIF.

El bloqueig de LIF, tant si es feia amb anticossos com si es feia per interferència d’ARN, induïa una disminució del creixement tumoral i, en conseqüència, un petit augment de la supervivència en els ratolins.

En aquests models, el bloqueig de LIF amb anticossos tenia un efecte sobre la via de senyalització JAK-STAT3 de les cèl·lules tumorals. Aquesta via de senyalització (particularment, els nivells de p-STAT3) participa en la proliferació tumoral. LIF, en aquests models, és la principal citocina inductora de la via JAK-STAT3. Sense LIF, es produeix un augment dels nivells de caspasa 3 (CC3), que es relaciona amb l’apoptosi (suïcidi cel·lular).

En models de ratolins immunodeficients (RAG-/-, NOD SCID), el bloqueig de LIF no té cap impacte en el creixement tumoral. En aquests ratolins no hi ha resposta immune adaptativa, i cal pensar que sense aquesta resposta, el bloqueig de LIF no té un efecte antitumoral.

El bloqueig de LIF altera la infiltració cel·lular en tumors

En els models de ratolins immunocompetents, l’acció antitumoral dels anticossos anti-LIF s’associa amb canvis en les cèl·lules associades als tumors. Hi ha una disminució en la quantia dels TAMs (macròfags derivats de monòcits CD11b+, Ly6G, Ly6C, CD49d+). Contràriament, augmenta el nombre de cèl·lules T CD8+, de cèl·lules NK i de cèl·lules T CD4+ (T reguladores). Les cèl·lules T CD8+ infiltrades expressen granzim A (GZMA), un enzim implicat en la resposta citotòxica; una part d’aquestes cèl·lules expressen PD1 (proteïna implicada en la inhibició de la resposta citotòxica). D’altres poblacions cel·lulars no s’hi veuen afectades, com és el cas de les cèl·lules dendrítiques (CD11b+, CD11c+, MHCII+). Ni el bloqueig anti-LIF ni la interferència de l’ARN de LIF alteren els nivells intratumorals de citocines com IL12 o IL10.

En models de ratolí amb tumors establerts, un tractament agut anti-LIF durant 4 dies és capaç de promoure la infiltració de cèl·lules T CD8+, si bé no arriba a afectar el creixement tumoral.

El bloqueig de LIF altera l’expressió de citocines per part dels macròfags associats a tumors

En el model de ratolí de tumor d’ovari ID8, Pascual-García et al. realitzaren una anàlisi transcriptòmica de les cèl·lules CD11b+. Observaren que els anticossos anti-LIF s’associaven amb una repressió de tot un seguit de gens (CCL2, CCL3, CCL7, PF4, CTSK, CD206 i CD163), però també amb un augment de l’expressió del gen CXCL9. Aquests canvis transcriptòmics també s’observaren amb un qRT-PCR sobre el model de ratolí de glioblastoma GL261N.

En ratolins CXCL9-/-, la inhibició de LIF no genera resposta anti-tumoral. Sí que es manté aquesta resposta, en canvi, en ratolins CCL2-/-.

El bloqueig simultani de LIF i de CXCL9 no produeix una resposta anti-tumoral en els models estudiats. En canvi, en el bloqueig simultani de LIF i de CCL2, sí es manté aquesta resposta anti-tumoral.

LIF i CXCL9

Pascual-García et al. remarquen que tant en el glioblastoma com en el càncer d’ovari hi ha una correlació positiva entre els nivells de LIF i els de CCL2 (així com dels marcadors CD163 i CD206). En canvi, no hi ha correlació entre els nivells de LIF i els de CXCL9.

En estudiar una cohort de 20 pacients de glioblastoma, Pascual-García et al. troben una correlació postiva entre LIF i CCL2, CD163 i CD206. En canvi, hi ha una correlació inversa en CXCL9. El patró d’expressió de CXCL9 en el glioblastoma sembla concentrar-se en algunes cèl·lules del tumor.

En cultius primaris de macròfags derivats de moll de l’os de ratolí, LIF és capaç de reprimir la inducció de CXCL9 per l’interferó-gamma. Aquesta repressió opera tant a nivell de proteïna CXCL9 com de l’ARN missatger del gen CXCL9. Una repressió similar té lloc per part de LIF quan la inducció de CXCL9 es fa a través de l’endotoxina bacteriana (LPS).

En macròfags associats a glioblastomes humans, LIF també reprimeix la inducció de CXCL9 per l’interferó-gamma.

El mecanisme d’aquesta repressió de LIF sobre el gen CXCL9 es troba en alteracions de la regió promotora del gen. Aquestes alteracions consisteixen en variacions del patró de metilació (H3K27me3) i d’acetilació (H4ac) de les histones d’aquesta regió, i en un augment de la unió d’aquesta regió amb la proteïna reguladora EZH2. Es tractaria doncs d’un silenciament epigenètic.

LIF interfereix en la infiltració de T CD8+ en un model organotípic de glioblastoma

Els models organotípics de tumors permeten la reproducció de l’arquitectura del teixit. Pascual-García et al. obtingueren cultius organotípics derivats de tres pacients de l’estudi. En tots tres casos hi havia nivells elevats de LIF. També hi havia un nivell elevat d’infiltració de TAMs Iba1+.

Els TAMs dels cultius organotípics de glioblastoma expressaven CCL2 i els marcadors CD163 i CD206. Després d’un tractament de tres dies amb anticòs anti-LIF hi havia una disminució en els TAMs de l’expressió de CCL2, CD163 i CD206, acompanyada d’un augment de l’expressió de CXCL9.

Pascual-García et al. exposaren talls organotípics derivats de pacients a cèl·lules mononuclears derivades del mateix pacient (autòlogues). Els talls tractats amb anti-LIF mostraven un canvi en el perfil de quimiocines (CXCL9 augmentava en detriment de CCL2) i hi havia una inducció de la infiltració de cèl·lules mononuclears. Entre les cèl·lules infiltrades hi havia limfòcits T CD8+. En els talls incubats amb anti-CXCL9, no hi havia però infiltració de cèl·lules T CD8+.

Un model in vivo en ratolins NSG

Fragments de tumors de quatre pacients foren utilitzats en un model in vivo en ratolins NSG. Alguns d’aquests ratolins foren tractats durant 5 dies amb anticossos neutralitzants anti-LIF. Després d’aquest tractament, s’injectava a ratolins cèl·lules mononuclears de sang perifèrica del mateix pacient.

Una vegada sacrificats els ratolins, s’estudiava el nivell d’infiltració dels tumors amb cèl·lules T. Els ratolins tractats amb anti-LIF eren els que mostraven uns valors més elevats d’infiltració. Les cèl·lules T CD8+ expressaven CXCR3 (que és el receptor de la CXCL9).

Les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica inclouen diversos tipus cel·lulars. Entre aquests hi ha limfòcits T CD3+. Pascual-García et al. aïllaren limfòcits de sang perifèrica dels pacients i els infectaren amb lentivirus modificats genèticament que expressen luciferasa. Quan s’inoculen aquestes cèl·lules infectades en els ratolins NSG amb tumors derivats de pacients, es pot monitoritzar la infiltració a través de la bioluminescència.

Teràpia dual amb anti-LIF i anti-PD1 en un model de ratolí

Pascual-García et al. sotmeteren a un model de ratolí immunocompetent a un tractament combinat amb anticossos anti-LIF i anti-PD1. Trobaren un augment de la supervivència i una regressió tumoral. Quan als ratolins tractats se’ls reinoculaven de nou cèl·lules tumorals, no apareixia cap tumor nou, signe de la generació d’una memòria immunològica efectiva.

LIF com a diana oncoterapèutica

Per Pascual-García et al., LIF és un factor oncogènic a través de la regulació del sistema immunitari. Aquesta acció de LIF s’explica per una repressió del gen CXCL9, el producte gènic del qual és important per a la infiltració del tumor amb cèl·lules T citotòxiques. Aquesta acció immunomoduladora explica la rellevància de LIF en la implantació de l’embrió en la paret uterina. Altres estudis han posat de manifest que LIF ajuda a controlar el rebuig d’òrgans transplantats i que és també un modulador en malalties autoimmunes com l’esclerosi múltiple.

LIF es trobaria al darrera de la resistència de tumors a les immunoteràpies anti-PD1. De fet, cal pensar que per als tumors uns nivells elevats de LIF actuen com un factor de protecció front a la infiltració de cèl·lules citotòxiques.

En l’actualitat, un anticòs monoclonal anti-LIF humanitzat, MSC-1, és objecte d’un assaig clínic de fase I. Aquest assaig clínic es realitza en l’Hospital Universitari de la Vall d’Hebron, en el Memorial Sloan Kettering Cancer Center de Nova York, i en el Princess Margaret Cancer Center de Toronto. La fase I té com a objectiu valorar la seguretat i eficàcia d’un fàrmac. La inhibició de LIF permet l’actuació de CXCL9 com a citocina de recrutament de cèl·lules citotòxiques. D’altra banda, la inhibició de LIF també afavoreix la diferenciació de les cèl·lules troncals tumorals, reduint el risc de dispersió metastàtica i de recurrència dels tumors.

Lligams:

LIF regulates CXCL9 in tumor-associated macrophages and prevents CD8+ T cell tumor-infiltration impairing anti-PD1 therapy. Mónica Pascual-García, Ester Bonfill-Teixidor, Ester Planas-Rigol, Carlota Rubio-Perez, Raffaella Iurlaro, Alexandra Arias, Isabel Cuartas, Ada Sala-Hojman, Laura Escudero, Francisco Martínez-Ricarte, Isabel Huber-Ruano, Paolo Nuciforo, Leire Pedrosa, Carolina Marques, Irene Braña, Elena Garralda, María Vieito, Massimo Squatrito, Estela Pineda, Francesc Graus, Carmen Espejo, Juan Sahuquillo, Josep Tabernero & Joan Seoane. Nature Communications 10: 2416 (2019).

Study to Evaluate Safety, PK, PD, Immunogenicity & Antitumor Activity of MSC-1 in Patients With Adv Solid Tumors. ClinicalTrials.gov NCT03490669.

Novel agent reactivates an immune call by LIF blockade. VHIO News.

Aquesta entrada ha esta publicada en 3. La Vida. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

Aquest lloc utilitza Akismet per reduir el correu brossa. Aprendre com la informació del vostre comentari és processada