L’ADN i l’ARN de vuit lletres: el sistema genètic hachimoji

Genètica molecular: Ara fa uns anys vam esmentar els àcids xenonucleics. En els àcids xenonucleics (XNA), per comptes d’emprar nucleòtids basats en la desoxiribosa (com fa l’ADN) o la ribosa (com fa l’ARN), s’utilitzen nucleòtids basats en altres molècules: arabinosa, hexitol, ciclohexè. Però sense moure’ns de l’ADN i de l’ARN és possible expandir el sistema genètic natural amb l’ús de bases nitrogenades diferents a les naturals: adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) o uracil (U). De fet, en els sistemes biològics, de vegades apareixen bases modificades, que tenen un rol epigenètic. Però la cosa és anar-hi més enllà. Un grup d’investigadors coordinats per Steven A. Benner i Shuichi Hoshika, de Firebird Biomolecular Sciences ens presenten un exemple d’ADN de nova generació. Hom ha dit que el sistema genètic de la biosfera terrestre consisteix en un alfabet de quatre lletres: A, G, C, T (la T és substituïda per U en l’ARN). La doble cadena d’ADN es fonamenta en els ponts d’hidrogen que es formen entre les G i C (tres ponts d’hidrogen) i les A i T (dos ponts d’hidrogen). Doncs bé, Hoshika et al. han desenvolupat l’ADN i ARN hachimoji (de vuit lletres en japonès). Per fer-ho han afegit a les cinc bases nitrogenades naturals unes altres cinc: P (2-aminoidazol[1,2-a][1,3,5]triazin-4(1H)-ona), B (isoguanina), rS (isocitosina), dS (1-metilcitosina) i Z (6-amino-5-nitropiridin-2-ol). D’aquesta manera l’ADN hachimoji utilitza vuit lletres: A, C, G, T, P, B, dS i Z. L’ARN hachimoji també n’utilitza vuit: A, C, G, U, P, B, rS i Z. En l’ADN hachimoji de doble cadena podem trobar, a més dels aparellaments G-C i A-T, els dS-B i Z-P. Hoshika et al. han aconseguit, doncs, de sintetitzar ADN hachimoji i, acoblant-lo amb una ARN polimerasa del virus T7 modificada, han aconseguit transcriure’l en ARN hachimoji. La finalitat d’aquest sistema genètica ampliat és aconseguir biopolímers amb una densitat superior d’informació que els àcids nucleics convencionals de quatre lletres. De moment, Hoshika et al. reporten que el seu sistema compleix els requeriments estructurals per seguir una evolució darwiniana: una espinada polielectrolítica, una predictible estabilitat termodinàmica i uns monòmers estereoregulars adaptables a un cristall aperiòdic de Schrödinger. A través d’estructures cristal·lines mostren com la doble hèlix de l’ADN hachimoji és homòloga a l’ADN yonmoji. A banda de les potencialitats en enginyeria genètica, l’ADN hachimoji també convida a reflexions cosmobiològiques més profundes.

Estructura química de l’ADN yonmoji, de quatre lletres, que és la forma habitual dels genomes de la nostra biosfera. En l’ADN hachimoji a les quatre lletres basades en l’adenina (A), la timina (T), la guanina (G) i la citosina (C), s’hi afegeixen les lletres P, B (isoguanina), S (isocitosina) i Z. Els parells de nucleòtids de l’ADN hachimoji són quatre: A-T, G-C, S-B, Z-P.

Un sistema genètic de vuit lletres

Shuichi Hoshika treballa a Firebird Biomolecular Sciences LLC, d’Alachua (Florida) i és membre de la Foundation for Applied Molecular Evolution (FAME) de la mateixa localitat. És qui ha sintetitzat i purificat tots els oligonucleòtids hachimoji, així com els nucleòtids hachimoji-3’-fosfats, i els derivats d’ARN hachimoji necessaris per a les anàlisis de traspàs de marcatge.

Nicole A. Leal, també d’Alachua, ha realitzat tots els estudis sobre reaccions enzimàtiques, inclosos la preparació de diversos transcrits d’ARN, i fou qui desenvolupà la química analítica de l’ARN hachimoji (estratègies de cromatografia bidimensional en capa fina, etc.).

La síntesi de totes les fosforamidites i trifosfats d’hachimoji es va dur a terme a Alachua, a càrrec de Kim Myong-Jung, Kim Myong-Sang, Nilesh B. Karalkar i Kim Hyo-Joong.

De DNA Software Inc. participen en aquest estudi Norman E. Watkins Jr., Holly A. SantaLucia i John SantaLucia Jr. Foren ells els qui dissenyaren els oligonucleòtids d’ADN hachimoji, realitzaren els estudis de temperatura de fusió i interpretaren les dades resultants.

Saurja DasGupta i Joseph A. Piccirilli són del Department of Biochemistry and Molecular Biology i del Department of Chemistry de la University of Chicago. Foren ells els qui realitzaren els estudis biofísics sobre la variant Z de l’aptàmer d’espinac.

Alison M. Bates i Millie M. Georgiadis treballen al Department of Biochemistry and Molecular Biology de la Indiana University School of Medicine, d’Indianapolis. Els correspongué de realitzar tots els estudis cristal·logràfics i d’analitzar les tres estructures cristal·lines que contenien ADN hachimoji.

Adam J. Meyer i Andrew D. Ellington són del Center for Systems and Synthetic Biology de la University of Texas. Prepararen les variants d’ARN-polimerasa de T7.

John SantaLucia, Georgiadis i Steven A. Benner dirigiren la recerca i redactaren l’article amb l’ajut dels altres coautors.

Molts dels autors d’aquest article tenen interessos comercials en la propietat intel·lectual que deriva d’aquests treballs. El finançament de la recerca depèn en part de projectes de la NASA (NNX15AF46G), del National Institute of General Medical Sciences (R41GM119494, R01GM128186, R01GM102489) i de la NSF (CHE 1507816), així com d’ajust de la Templeton World Charity Foundation Inc. Els autors també agraeixen els serveis d’Accelero Biostructures Inc. en l’obtenció de dades cristal·logràfiques de difracció de raigs X.

L’article fou tramès a Science el 23 de gener del 2018. Les exigències dels revisors conduïren a una ampliació que fou tramesa el 25 de setembre del 2018, i que fou acceptada el 31 de gener d’enguany. La publicació tingué lloc el 22 de febrer.

L’ADN hachimoji persegueix augmentar la densitat d’informació respecte l’ADN convencional. Si en l’ADN convencional hi ha quatre tipus diferents de nucleòtids, en l’ADN hachimoji n’hi ha vuit. Erwin Schrödinger, en l’època fundacional de la biologia molecular, teoritzà sobre els requeriments estructurals dels nucleòtids per tal de formar un cristall aperiòdic capaç d’emmagatzemar i transferir de manera fiable informació molecular. Per construir l’ADN hachimoji calia complir els requeriments de Schrödinger. Sense complir-los, no seria possible construir per als biopolímers resultants de seguir l’evolució darwiniana.

Si pensem en l’ADN convencional, veurem que les quatre bases nitrogenades que conté són molècules polars, i que això facilita la formació de ponts d’hidrogen. Aquesta és la base química de la complementarietat A-T i C-G, i de fet també això explica que el parell C-G tingui una força d’enllaç superior (consisteix en tres pont d’hidrogen, mentre que en A-T n’hi ha tan sols dos). No obstant, ha estat possible la introducció de nucleòtids hidròfobs en sistemes genètics. Així, els ponts d’hidrogen no serien potser imprescindibles per a aconseguir molècules darwinianes, però sí ho seria el manteniment d’una complementarietat de mida. El problema és que els nucleòtids hidròfobs acaben per alterar l’estructura de doble hèlix.

L’ADN rokumoji, o de sis lletres, ha estat també proposat. Les sis lletres formen tres parells de nucleòtids determinats per ponts d’hidrogen. L’ADN rokumoji és capaç de reproduir comportaments característics de l’ADN de quatre lletres: se’l pot copiar, se’l pot amplificar, se’l pot seqüenciar, se’l pot transcriure i retrotranscriure, se’l pot traduir a proteïnes amb aminoàcids addicionals. En resum, l’ADN rokumoji té tots els elements d’una molècula darwiniana.

L’ADN hachimoji va un pas més enllà encara: vuit lletres. Es tracta de dissenyar dos conjunts addicionals d’heterocicles que forneixin dos patrons addicionals de formació de ponts d’hidrogen. Hoshika et al. en aquest disseny es basen en els paràmetres termodinàmics dels diferents dímers.

40 paràmetres de dímers per a l’ADN hachimoji

En l’ADN de quatre lletres els paràmetres requerits per avaluar les interaccions entre les 4 bases nitrogenades és de 12. En l’ADN de vuit lletres el nombre de paràmetres passa a 40.

Els quatre aparellaments de l’ADN hachimoji són G:C, A:T, S:B i Z:P. S és una pirimidina (3-metil-6-amino-5-(1’-β-D-2’-desoxiribofuranosil)-pirimidin-2-ona). B és una purina (6-amino-9[(1’-β-D-2’-desoxiribofuranosil)-4-hidroxi-5-(hidroximetil)-oxolan-2-il]-1H-purin-2-ona). Z és una altra pirimidina (6-amino-3-(1’-β-D-2’-desoxiribofuranolsil)-5-nitro-1H-piridin-2-ona). P és una altra purina (2-amino-8-(1’-β-D-2’-desoxiribofuranosil)-imidazo-[1,2a]-1,3,5-triazin-[8H]-4-ona). Tenim, doncs, quatre purines (G,A,B i P) i quatre pirimidines (C,T,S i Z).

Per obtindre els 40 paràmetres, es dissenyaren 94 duplex entre els nucleòtids estàndards (A, T, G, C), els anàlegs de purina (P, B) i els anàlegs de pirimidina (Z, S).

Els oligonucleòtids aparellats d’ADN hachimoji eren sintetitzats per química de fase sòlida a partir de fosforamidites sintètiques. A partir d’ells es calculaven les temperatures de fusió de cadascun dels 94 parells possibles de nucleòtids, i les ΔGo37 i ΔHo de cadascun d’ells.

Les dades resultats d’aquests experiments indicaven que l’ADN hachimoji GACTZPSB és un sistema informacional.

La mutabilitat de l’ADN hachimoji

Per què un sistema genètic sigui darwinià cal que pugui mutar sense que això danyi el cristall aperiòdic de Schrödinger que és la doble hèlix.

Hoshika et al. obtingueren les estructures cristal·lines d’alta resolució pels tres dúplex d’hachimoji. Per això sintetitzaren tres oligonucleòtids dúplexs: 5′-CTTATPBTASZATAAG 5′-CTTAPCBTASGZTAAG i 5′-CTTATPPSBZZATAAG. Els cristal·litzaren amb la retrotranscriptasa del virus de la leucèmia murina de Moloney. En tots tres casos l’ADN adoptava una forma B, amb 10,2-10,4 parells de bases per gir.

Les tres conformacions principals de l’ADN són les formes A, B i Z

L’ADN hachimoji té una estructura més semblant a l’ADN ric en GC que no pas a l’ADN pobres en GC. Els parells S:B tenen, però, un angle d’obertura superior als parells G:C. Els parells P:Z, es diferencien dels parells G:C, en presentar un angle de sivella superior. De tota manera, l’ADN hachimoji compleix el requeriment de Schrödinger de poder formar essencialment el mateix cristall aperiòdics, amb independència de la seqüència concreta de parells de bases. Això fa possible mutar la seqüència bo i conservant la doble hèlix.

La transcripció de l’ADN hachimoji a ARN

L’ARN hachimoji també disposa de vuit nucleòtids diferents. Com passa amb l’ADN de quatre lletres, el lloc de la timina (T) és ocupat per l’uracil (U). També hi ha un canvi en la base S (en lloc de la 1-metilcitosina hi ha la isocitosina), però Hoshika et al. reté el símbol S, de manera que l’ARN hachimoji es pot expressar com a GACUZPSB.

Per aconseguir la transcripció de l’ADN hachimoji havien de desenvolupar noves ARN polimerases. Establiren un assaig basat en el marcatge amb [α-32P]citidina-5’-trifosfat, la digestió amb ribonucleasa T2 i una cromatografia en capa fina.

L’ARN polimerasa T7 nativa és capaç d’incorporar riboZTP en llegir dP, riboPTP en llegir dZ i riboBTP en llegir dS. L’única posició en la que fallava era en afegir riboSTP en llegir dB. És remarcable que un enzim natural propi de l’ADN de quatre lletres pugui gairebé servir en forma nativa en l’ADN hachimoji. Però només és “gairebé”. Així doncs, Hoshika et al. van haver de cercar variants de l’ARN-polimerasa T7 que poguessin transcriure tots els quatre nous nucleòtids.

La variant FAL de l’ARN-polimerasa T7 presenta tres mutacions (Y639F, H784A, P266L). És especialment efectiva en incorporar riboSTP en llegir dB. Originàriament, aquesta variant havia estat desenvolupada com a polimerasa termostable capaç d’acceptar 2’-O-metil trifosfats. La variant FAL també incorporava els altres nucleòtids addicionals de l’ARN hachimoji.

Emprant l’ARN-polimerasa T7, Hoshika et al. pogueren sintetitzar una variant hachimoji de l’aptàmer d’ARN fluorescent d’espinac. La fluorescència la dona la 3,5-difluoro-4-hidroxibenziliden-imidazolinona.

L’ADN hachimoji: aplicacions i reflexions

Hoshika et al. ens presenten, doncs, un sistema genètic mutable basat en vuit mononucleòtids diferents. Passar de quatre mononucleòtids a vuit implica augmentar la densitat d’informació de la seqüència genètica. Un ADN hachimoji d’una longitud de n parells de nucleòtids pot presentar 8n seqüències diferents. Així una molècula d’ADN convencional de 16 nucleòtids pot tindre 4.294.967.296 seqüències diferents. Una molècula d’ADN hachimoji de la mateixa longitud en té 281.474.976.710.656 seqüències diferents. La major densitat informativa de l’ADN hachimoji li ofereix aplicacions en codificacions, marcatge combinatorial, emmagatzematge d’informació recuperable i en nanostructures d’autoensamblatge. Però, a més, l’ADN hachimoji és un sistema capaç de realitzar evolució molecular.

Que l’ADN hachimoji tingui aquestes potencialitats mostra com potser no hi ha res de particular en les bases G, A, C i T. L’actual sistema genètic de la biosfera terrestre es fonamenta en aquestes bases nitrogenades, però podrien haver altres sistemes genètics que utilitzin diferents combinacions de 4, 6, 8 i potser més bases nitrogenades. Qui sap si algun microorganisme encara no descobert en la biosfera terrestre no presenta potser un sistema genètic alternatiu amb algun altre parell de nucleòtids diferents de GC i AT? I qui sap quines combinacions existeixen en les biosferes hipotètiques d’altres planetes?

Lligams:

Hachimoji DNA and RNA: A genetic system with eight building blocks. Shuichi Hoshika, Nicole A. Leal, Myong-Jung Kim, Myong-Sang Kim, Nilesh B. Karalkar, Hyo-Joong Kim, Alison M. Bates, Norman E. Watkins Jr., Holly A. SantaLucia, Adam J. Meyer, Saurja DasGupta, Joseph A. Piccirilli, Andrew D. Ellington, John SantaLucia Jr., Millie M. Georgiadis, Steven A. Benner. Science 363: 884-887 (2019).

Aquesta entrada ha esta publicada en 3. La Vida. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

Aquest lloc utilitza Akismet per reduir el correu brossa. Aprendre com la informació del vostre comentari és processada