La reactivació de les cèl·lules B de memòria es realitza en focus proliferatius subcapsulars dels ganglis limfàtics

El sistema immunitari dels vertebrats es caracteritza per la seva memòria, és a dir la capacitat en alguns casos de reprendre una resposta immune específica contra un patògen amb el qual es tingué un contacte previ. Aquesta memòria immune és el fonament dels vaccins, que tenen com a objecte desencadenar-la sense haver de passar per la infecció corresponent. La memòria immune, entre d’altres coses, comportarà la generació de limfòcits B de memòria, és a dir limfòcits B capaços de fabricar anticossos contra els antígens inclosos en el vaccí. Tant en la memòria immune induïda amb vaccins com en la memòria immune natural, aquestes cèl·lules B de memòria esdevenen crucials: quan l’organisme es trobi amb els antígens corresponents, les cèl·lules B de memòria es reactivaran i sintetitzaran anticossos neutralitzants específics. Malgrat tots els avenços que hi ha hagut en el darrer segle per conèixer la natura proteica dels anticossos i dels mecanismes genètics que n’expliquen l’especificitat, encara hi ha elements poc o gens clars. Un d’aquests és la localització del procés de reactivació de les cèl·lules B de memòria i d’alguns dels mecanismes implicats. Imogen Moran i Tri Giang Phan del Garvan Institute of Medical Research, de Sydney, han impulsat una recerca que, fent ús de la microscopia intravital, mostra que les cèl·lules B de memòria es localitzen en l’espai subcapsular dels ganglis limfàtics. Quan aquestes cèl·lules B de memòria són activades per la presència de l’antigen corresponent, proliferen ràpidament i es diferencien en cèl·lules plasmàtiques secretores d’anticossos. En aquest procés no abandonen l’espai subcapsular, sinó que dins d’ell hi formes focus proliferatius. És també en aquest espai on es produeixen les interaccions que afinaran la resposta immunitària, a través de la interacció amb limfòcits TH fol·liculars i de macròfags presentadors d’antígens. En un article a la revista Nature Communications, Moran et al. expliquen la natura d’aquests focus proliferatius subcapsulars (SPF, en l’acrònim anglès), dels quals destaquen la signatura molecular monocel·lular (o clonal), els patrons de migració cel·lular i la sortida de cèl·lules plasmàtiques. De moment, han descrit la presència de SPF en els ganglis limfàtics tant humans com murins. Moran et al. defineixen els SPF com “seus de memòria immunològica” i reconeixen que poden ésser una diana interessant “per mobilitzar ràpidament respostes secundàries d’anticossos” i “per millorar l’eficàcia de vaccins”.

Microfotografia d’un gangli limfàtic en el qual s’assenyala la càpsula (1), el sinus subcapsular (2), uns centres germinals (3), uns nòduls limfoides (4) i les trabècules (5)

La reactivació de cèl·lules B de memòria

Aquest estudi fou concebut i dissenyat per Imogen Moran i Tri Phan, de la Immunology Division del Garvan Institute of Medical Research. El disseny dels experiments monocel·lulars els feren amb Akira Nguyen. La seqüenciació d’ARN monocel·lular la van fer Moran i Nguyen amb Weng Hua Koo (de la Division of Bone Biology del mateix centre). Nguyen analitzà aquesta seqüenciació. Dins de la Immunology Division, Danyal Butt, Katherine Bourne, Clara Young i Jana R. Hermes hi prestaren suport tècnic. En el disseny experimental i en l’anàlisi i interpretació posteriors també contribuïren Cindy S. Ma, C. Mee Ling Munier, Fabio Luciani, John Zaunders, Anthony D. Kelleher, Stuart G. Tanye, Peter I. Croucher i Robert Brink. Maté Biro forni eines d’anàlisi d’imatges, tasca que realitzaren Moran i Mark N. Read. Read també realitzà la modelització matemàtica. Gary Gracie i Andrew Parker realitzaren la immunohistoquímica humana. L’article fou redactat per Moran, Nguyen, Read i Phan.

La recerca compta amb el finançament del NHMRC, a través dels projectes 1124681 (on participen Phan, Ma, Luciani i Zaunders) i 1139865 (on participen Phan i Ma).

El seu article comença amb una referència a aquell famós passatge de Tucídides:

“ἐπὶ πλέον δ᾽ ὅμως οἱ διαπεφευγότες τόν τε θνῄσκοντα καὶ τὸν πονούμενον ᾠκτίζοντο διὰ τὸ προειδέναι τε καὶ αὐτοὶ ἤδη ἐν τῷ θαρσαλέῳ εἶναι: δὶς γὰρ τὸν αὐτόν, ὥστε καὶ κτείνειν, οὐκ ἐπελάμβανεν. καὶ ἐμακαρίζοντό τε ὑπὸ τῶν ἄλλων, καὶ αὐτοὶ τῷ παραχρῆμα περιχαρεῖ καὶ ἐς τὸν ἔπειτα χρόνον ἐλπίδος τι εἶχον κούφης μηδ᾽ ἂν ὑπ᾽ ἄλλου νοσήματός ποτε ἔτι διαφθαρῆναι.” (Thuc 2.51.6.)

Tucídides ens explica que en la pesta que assolà a Atenes en el 430 a.C., les poques persones que sobrevisqueren després d’haver patit la malaltia, foren també les que mostraren més compassió envers els malalts i moribunds. Aquests supervivents creien que no emmalaltirien de nou i en tot cas no de tanta gravetat. Alguns arribaren a pensar que el fet d’haver sobreviscut a la malaltia els feia invulnerables a tota dolència en el futur.

La immunitat existeix. En el segle XVII, metges de la Índia, de la Xina, de l’Imperi Otomà o d’Europa estudiaren i practicaren la inoculació d’extractes de pústules de malalts de verola com a mètode preventiu contra aquesta malaltia. Edward Jenner, en el 1796, modificà aquesta pràctica emprant en la inoculació pústules de malalts de verola de vaques: la vaccinació era menys arriscada que la variolació. En el segle XIX, Louis Pasteur i d’altres científics multiplicaren aquestes experiències. En el segle XX, les bases cel·lulars i moleculars de les malalties infeccioses i dels seus vaccins començaren a ser aclarides.

La protecció immunitària que confereixen els vaccins és en gran mesura de caràcter humoral, és a dir que resideix en el sèrum sanguini i no tant en la fracció cel·lular. Ara bé, els anticossos neutralitzants responsables d’aquesta immunitat humoral són secretats per cèl·lules. La persistència de la immunitat s’explica per la presència de cèl·lules plasmàtiques de llarga vida i per cèl·lules B de memòria.

Fins ara hom sabia que les cèl·lules B de memòria (MBC en l’acrònim anglès) es trobaven en localitzacions anatòmiques exposades a antígens, com ara el pulmó després d’una infecció viral, la zona marginal de la melsa, el moll de l’os, l’epiteli de les angines, etc. Després d’una immunització subcutània, se sap que les MBCs resultats s’acumulen en els ganglis limfàtics.

És més ben coneguda a nivell molecular l’activació de limfòcits B immadurs. Aquesta activació depèn de la interacció amb macròfags CD169+ que es troben en l’espai subcapsular del gangli limfàtic. Les cèl·lules B activades d’aquesta manera migren cap a la zona interfol·licular, on interactuen amb limfòcits TH. La interacció entre limfòcits T i aquests limfòcits B marcarà si proliferen o no, i si ho fan, si es diferencien cap a cèl·lules plasmàtiques de curta vida o cap a cèl·lules B residents entre el centre germinal del fol·licle limfàtic.

Moran et al. volen aclarir les bases cel·lulars i histològiques de la resposta humoral secundària. Ho han una combinació de microscopia intravital bifotònica i de seqüències d’ARN d’una sola cèl·lula. És així com han identificat l’estructura que denominen “focus proliferatius subcapsulars” (SPF). En aquests SPF les MBCs reactivades proliferen i es diferencien en cèl·lules plasmàtiques. Les cèl·lules de l’SPF són més mòbils, però també més dependents de senyals externs per sobreviure.

El lloc de residència de MBCs en repòs

Moran et al. utilitzen un model de ratolí immunitzat a la lisozima d’ou de gallina (proteïna HEL), combinat amb l’administració de cèl·lules B modificades genèticament que han incorporat marcadors fluorescents com la proteïna Kaede. Quan han passat 28 dies de la primera resposta d’anticossos, les cèl·lules específiques d’aquest antigen ja no proliferen. Tampoc ja no persisteixen els centres germinals en els ganglis limfàtics. Sí que persisteixen, en canvi, MBCs, que no dependen per a sobreviure de senyals antigènics en els seus receptors BCR ni tampoc de l’assistència de limfòcits TH específics.

En aquests MBCs hi ha dues subpoblacions. Unes expressen anticossos IgM i unes altres anticossos IgG. Entre els marcadors característics de les MBCs hi ha Fas, CD80, CD86, PD-L2, CCR6, CD69, CD62L, EBI2 i CXCR3.

L’ús de microscopia intravital bifotònica demostrava 70 dies de la immunització primària que les MBCs es posicionaven preferentment en la regió subcapsular dels ganglis limfàtics, associats estretament amb les macròfags SCS CD169+.

Les MBCs eren el doble d’abundants en ganglis limfàtics de drenatges comparats amb els altres ganglis limfàtics. L’expressió de la proteïna fluorescent Kaede permet Moran et al. de calcular els temps de residència en el gangli limfàtic, que estimen en 69 hores.

El comportament migratori de MBCs i de cèl·lules B immadures

El temps de residència d’una cèl·lula B immadura en el gangli limfàtic és inferior a les 24 hores. En els seus experiments, Moran et al. comparen les MBCs amb aquestes cèl·lules B immadures. La velocitat mitjana és similar en tots dos casos. També en tots dos casos la motilitat segueix un patró de migració superdifusiu.

La reactivació de les MBCs

Moran et al, transfereixen a ratolins cèl·lules B SWHEL tdTomato i cèl·lules T OT2. En immunitzar els ratolins amb HEL-OVA, queda establerta una població de MBCs que poden seguir amb el microscopi vital gràcies al marcatge de fluorescèndia (tdTomato). Eventualment, aquests ratolins són inoculats de nou amb HEL-OVA.

Cinc dies després d’aquesta segona inoculació, els MBCs SWHEL s’havien segregat en dues agrupacions diferents, una en la regió subcapsular i l’altra en centres germinals secundaris.

El marcatge OT2 els permetia seguir també els moviments de les cèl·lules T. En la regió subcapsular i en el mantell fol·licular dels ganglis limfàtics hi havia una acumulació de cèl·lules Tfh secundàries. La microscopia intravital detecta contactes freqüents i efímers entre les cèl·lules Tfh OT2 i les MBCs SWHEL. És la primera vegada que es mostra que la regió subcapsular dels ganglis limfàtics és una zona d’interacció entre cèl·lules T i B.

L’anàlisi histològica dels ganglis limfàtics

En el dia 3 i dia 5 de l’esmentada inoculació secundària, Moran et al. extreuen d’alguns ratolins ganglis limfàtics per sotmetre’ls a una anàlisi histològica. Les cèl·lules subcapsulars són proliferatives (positives per al marcador Ki67). Per això Moran et al. anomenen a aquesta estructura “focus proliferatius subcapsulars” (SPF). Els SPF recorden als centres germinals, però en aquest cas no hi ha presència de cèl·lules dendrítiques fol·liculars CD35+. En els SPF detecten una abundància d’anticossos anti-HEL, indici doncs que els SPF les MBCs proliferen i es diferencien en cèl·lules plasmàtiques.

Dues subpoblacions segons l’expressió de Blimp-1

Mitjançant el constructe Blimp-1egfp/+, Moran et al. poden observar en els SPFs l’expresió de Blimp-1. D’aquesta manera diferencien entre les cèl·lules Blimp-1+, que són rodones, poc mòbils i que romanen la superfície de macròfags SCS, de les cèl·lules Blimp-1neg, que són més mòbils.

La seqüenciació d’ARN

La seqüenciació monocel·lular d’ARN ens dóna les dades del transcriptoma d’una única cèl·lula. Moran et al. han fet aquest experiment per a un total de 142 cèl·lules B SWHEL obtingudes 5 dies després de la reinoculació de l’antigen. D’aquestes 142 cèl·lules, se n’obtingueren transcriptomes de 122. En total, detecten 8190 gens d’expressió diferencial, la qual cosa permet classificar-los en tres poblacions:
– la població 1 es caracteritza per l’expressió de gens relacionats amb la hipermutació somàtica, la divisió cel·lular i la mitosi.
– la població 2 es caracteritza per l’expressió de gens relacions amb l’estrès de reticle endoplasmàtic i la secrecció d’anticossos.
– la població 3 es caracteritza per l’expressió de gens associats al tràfic cel·lular dins del fol·licle limfàtic.

Aquestes dades d’ARN coincideixen amb les dades de la microscopia intravital. Així, en l’SPF trobem cèl·lules plasmàtiques (població 2), MBCs (població 3) i cèl·lules B de centre germinal (població 1)

A partir de les dades d’ARN, Moran et al. poden dissenyar un protocol de citometria de flux per caracteritzar millor les tres poblacions:
– la població 1 són cèl·lules CD38lo, amb un baix contingut d’immunoglobulina i que són positives per a Bcl-6.
– la població 2 són cèl·lules CD38int, amb un contingut intermedi d’immunoglobulina i que són negatives per a Bcl-6.
– la població 3 són cèl·lules CD38hi, amb un alt contingut d’immunoglobulina intracel·lular i que són negatives per a Bcl-6.

La supervivència de les cèl·lules de SPF en absència de senyalització per BCR

Emprant cèl·lules B SWHEL que porten els al·lels H2-Ab1fl/fl.Cd79a.CreERT2, Moran et al. poden induir la deleció de l’MHCII de les MBCs si administren tamoxifè als ratolins transferits 7 dies abans de la reinoculació amb HEL. En aquest cas, totes les poblacions cel·lules dels SPF es veuen reduïdes. Això indica la necessitat d’interacció amb cèl·lules TH a través del receptor BCR. De totes maneres, aquesta interacció no és imprescindible per a la supervivència de MBCs en els SPF. Experiments de Moran et al. amb ibrutinib confirmen aquesta idea.

SPF en ganglis limfàtics humans

Tota aquesta llista d’experiments s’han fet en ratolins. Moran et al., però, investiguen a més si els SPF són també presents en ganglis limfàtics humans. Així, analitzen seccions seriades de ganglis limfàtics inflamats procedents de biòpsies humanes de tres pacients. Hi detecten efectivament cúmuls de cèl·lules plasmàtiques CD138+ en la regió subcapsular, que es troben en contacte amb macròfags SCS CD169+.

Moran et al. afirmen que aquesta troballa dels SPF forneix un mecanisme per explicar la ràpida cinètica de la resposta secundària d’anticossos. És aquesta ràpida secreció d’anticossos la que protegeix l’hoste d’una nova infecció. Així, doncs, en els SPFs on rau la memòria de les cèl·lules B.

Lligams:

Memory B cells are reactivated in subcapsular proliferative foci of lymph nodes. Imogen Moran, Akira Nguyen, Weng Hua Khoo, Danyal Butt, Katherine Bourne, Clara Young, Jana R. Hermes, Maté Biro, Gary Gracie, Cindy S. Ma, C. Mee Ling Munier, Fabio Luciani, John Zaunders, Andrew Parker, Anthony D. Kelleher, Stuart G. Tangye, Peter I. Croucher, Robert Brink, Mark N. Read, Tri Giang Phan. Nature Communications 9: 3372 (2018)

Aquesta entrada ha esta publicada en 4. L'Animal. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

Aquest lloc utilitza Akismet per reduir el correu brossa. Aprendre com la informació del vostre comentari és processada