La microscopia de fluorescència d’alta resolució (Betzig, Well, Moerner: Premi Nobel de Química)

La Reial Acadèmia de Ciència ha anunciat que el Premi Nobel de Química ha recaigut en Eric Betzig, Stefan W. Hell i William E. Moerner “pel desenvolupament de microscopia de fluoresència de sobreresolució“. És l’exemple d’una línia de recerca que hom no sabria ben bé en quina categoria “Nobel” situar-la. Lo més normal hauria estat donar-los el Premi Nobel de Física (pel rol de la física en el desplegament de les tècniques microscòpiques). Una altra opció seria donar-los el de Fisiologia o Medicina, per les aplicacions biològiques d’aquesta tècnica microscòpia. Hom els ha donat finalment el de Química degut a la rellevància d’aquesta tècnica en bioquímica. Com va passar dilluns, un dels guardonats amb el Nobel ho ha estat també enguany amb el Premi Kavli (Hell, en la categoria de nanociència).

Eric Betzig

Eric Betzig (*Ann Arbor, Michigan, 13.1.1960) es va graduar en física al California Institute of Technology (1983). Va fer el mestratge en física aplicada i d’enginyeria a la Universitat de Cornell (1985), on s’hi doctorà (1988). Ingressa després en el Departament de Recerca de Física de Semiconductors en els AT&T Bell Laboratories. En el 1996 s’incorporà a l’empresa familiar, Ann Arbor Machine Company, sota la direcció del seu pare, Robert Betzig, ocupant la vicepresidència de recerca i desenvolupament. Desenvolupà per a la companyia la tecnologia servohidràulica adaptativa flexible (FAST en el backònim anglès). El FAST no acabà de prendre comercialment, i Betzig tornà al seu interès de recerca sobre microscopia. Reeixí amb el desenvolupament de la microscopia de localització fotoactivada (PALM, en el backònim anglès). En el 2006 entrà en el Campus de Recerca de Janelia Farm, centre adscrit al Howard Hughes Medical Institute. El seu grup de recerca s’orienta a la tècniques de fluorescència de “super-resolució”.

Stefan W. Hell

Stefan W. Hell (*Arad, Banat, Romania, 23.1.1962) estudià física a la Universitat de Heidelberg. Interessat en la microscopia confocal, el seu director de tesi fou Siegfried Hunklinger. La tesi, titulada, “Imatgeria de microstructures transparents en un microscopi confocal”, fou defensada reeixidament el 1990. La millora de la resolució axial de la microscopia confocal esdevingué l’objecte de la seva recerca posterior en el European Molecular Biology Laboratory de Heidelberg (1991-1993), que conduí al desenvolupament de la microscopia 4Pi. Després d’una estada de sis mesos a Oxford, liderà un grup de recerca en el departament de Física Mèdica de la Universitat de Turku (1993-1996). S’habilità com a professor de física a Heidelberg el 1996. Fundà el Departament de Nanobiofotònica a l’Institut Max Planck de Química Biofísica. També és cap de la Divisió de Nanoscopia Òptica del Centre de Recerca del Càncer (DKFZ) de Heidelberg. Gràcies a les seves contribucions a la microscopia de depleció per emissió estimulada (STED) hom ha arribat a dur el poder de resolució de la microscopia fluorescència més enllà dels límits de la longitud d’ona.

W. E. Moerner

William Esco Moerner va nàixer a la base aèria de Parks, a Pleasanton, Califòrnia, el 24 de juny del 1953. Per diferenciar-se del seu pare i del seu avi patern, tots homònims, escriu el seu nom habitualment com a W. E. Moerner. Va estudiar a la Washington University, a St. Louis, on es va graduar en física, en enginyeria elèctrica i en matemàtiques (1975). Va fer el mestratge (1975-1978) i el doctorat (1978-1982) a la Cornell University, en el grup de recerca d’Albert J. Sievers III. La seva tesi tractava de la dinàmica de relació vibracional de làmines d’halurs alcalins excitades amb làsers d’infraroig. Fins i tot abans d’acabar la tesi, ja havia començat a treballar com a investigador en el Centre de Recerca de Almaden d’IBM, a San Jose (California), on seria promogut a cap de projecte el 1989. El curs del 1993-1994 fou professor visitant de química física al ETH de Zuric. El 1995 deixà el Centre de Recerca d’IBM per esdevindre professor de química física de la Universitat de Califòrnia a San Diego (1995-1998). El seu grup de recerca es traslladà a la Universitat de Stanford el 1998, on continua actualment dedicat a l’espectroscopia de molècules aïllades, la microscopia de gran resolució i nanofotònica.

La microscopia òptica de fluorescència de molt alta resolució

Ernst Abbe (1873) va formular la idea del “límit de difracció” per a la microscopia, segons la qual és impossible resoldre dos elements d’una estructura que siguin més a prop entre ells que la meitat de la longitud d’ona en el pla lateral. Així s’establia per a la microscopia òptica una espècie de “non plus ultra”, en el qual hom no havia d’esperar superar els 200 nm (0,2 micres) de poder de resolució. En aquella època, aquest límit semblava llunyà. Resolucions d’1 micra ja semblaven prou precises per reconèixer estructures cel·lulars en preparacions de teixits. Si de cas, el repte central era l’ús de metodologies de tinció o fixació que augmentessin el contrast sense introduir un excés d’artefactes. Però el desenvolupament de la histologia i de la citologia formulava continuadament noves preguntes i la recerca en formes d’augmentar el poder de resolució en fou estimulada. La microscopia d’ultraviolat era una via, car la llum ultraviolada té una longitud d’ona més petita que la llum visible. Però la microscopia electrònica (amb longitud d’ona encara menors), desenvolupada en el 1939, i aplicada a partir dels anys 1950, seria la que obriria les portes a la subestructura cel·lular. Ara bé, les preparacions en microscopia electrònica exigeixen processos de fixació que impedeixen la microscopia “in vivo”. Per això, cal recórrer a la microscopia òptica i a les seves derivacions.

La microscopia òptica clàssica empra únicament els principis de la reflexió i absorció de la llum. En la microscopia de fluorescència, hom empra, a més, dues altres propietats, la fluorescència i la fosforescència. Així com en la microscopia clàssica, hom empra tinció per poder distingir estructures que altrament serien “transparents”, també en la microscopia de fluorescència hom pot emprar substàncies fluorescents per marcar estructures. L’esquema bàsic del microscopia de fluorescència és:

La preparació rep una llum d’excitació (blava en l’esquema, però que també pot ser ultraviolada) i components fluorescents nadius o afegits emeten una llum menys energètica (verda en l’esquema, però que pot ser també d’altres colors)

Tot i que el límit d’Abbe de la microscopia de fluorescència va més enllà de la microscopia òptica d’absorció/reflexió, ens deixa igualment en l’ordre de dècimes de micra. Per al microscopi biològic això és suficient per a observar els orgànuls cel·lulars principals, però no per a observar complexos macromoleculars (com ara, els ribosomes, que no foren descrits fins a l’adveniment de la microscopia electrònica) i, ja no diguem, molècules individuals.

Ara com ara, tan sols dues tècniques de microscopia de fluorescència permeten assolir poders de resolució que van més enllà del límit d’Abbe. Les dues reben el nom de “super-resolutives”, per aquest motiu. Una es basa en la col·lectivitat estatística de fluoròfors, i l’altre en fluoròfors individuals.

La microscopia de fluoròfor col·lectiu super-resolutiva fou assolida amb els microscopis de depleció per emissió estimulada (STED). La depleció elimina la fluorescència de totes les molècules d’una mostra excepte les d’una petita regió. L’emissió estimulada permet reduir aquesta regió més enllà del límit d’Abbe. La microscopia d’il·luminació estructrural saturada (SSIM) supera el límit d’Abbe a través de la saturació de pics d’excitació. Tant en un cas com en l’altre és necessària una reconstrucció computeritzada a partir de les dades de fluorescència.

La microscopia de fluoròfor individual es basa en la idea que cada fotó emès pels fluoròfors d’una mostra procedeix al capdavall d’un fluoròfor concret. Cada fluoròfor individual es troba separat de la majoria dels altres fluoròfors de la preparació per una distància superior al límit d’Abbe. La posició respecte de la minoria de fluoròfors que són més a prop (i que, per tant, compartirien la mateixa “taca” en la microscopia de fluorescència convencional) pot ser calculada a partir de la majoria de fluoròfors.

Els guardonats amb el Nobel d’enguany participaren precisament en les bases teòriques i pràctiques d’aquestes dues tècniques. Stefan E. Hell & Jan Wichmann (1994) proposaren l’estratègia de l’emissió estimulada, que podia dur el poder de resolució a 35 nm (gairebé tocant els 30 nm d’un ribosoma). S. W. Hell & M. Kroug (1995) aprofundiren en aquesta estratègia de “depleció” de la fluorescència de la perifèria, i calcularen que podien assolir una resolució lateral de 15 nm. El primer microscopi STED, basat en aquesta tècnica, permetia efectivament analitzar en cèl·lules vives una regió de 90-110 nm de diàmetre (0,67 attolitres de volum), la qual cosa era 18 vegades més precisa que la microscopia confocal (Klar et al., 2000). En el microscopi STED hom irradia la mostra amb dos làsers, el segon dels quals serveix per “esgotar” el fluoròfors de la perifèria, deixant intactes els dels volum d’enfocament. En un principi, la capacitat de resolució de l’STED no tindria cap límit constitutiu (a l’estil del límit d’Abbe), sinó límits marcats per diverses consideracions de costos tècnics, d’idoneïtat de la tècnica amb el procés vital que volem observar (que pot veure’s afectat si hom empra un làser massa potent durant massa estona).

Mats G. L. Gustafsson probablement hauria rebut el Premi Nobel avui sinó s’hagués mort en el 2011 a causa d’un tumor cerebral. Gustafsson (2005) proposà la microscopia d’il·luminació estructurada (SSIM), amb la qual arribà a poder de resolució laterals inferiors a 50 nm

L’aproximació de fluoròfors individuals té precedents en les tècniques d’espectroscopia de correlació de fluorescències (FCS) i en la microscopia de fluorescència de reflexió interna total (TIRF). W. E. Moerner & L. Kador (1989) aconseguiren detectar òpticament molècules individuals de pentacè en un cristall de p-terfenil a temperatures de 4 K: cada molècula individual era observada d’acord amb l’absorció de fotons que feien amb motiu d’una transició. Eric Betzig & Robert J. Chichester (1993) observaren molècules individuals de carbocianina, arribant a determinar l’orientació de cada dipol molecular. Les aportacions teòriques de Betzig (1995) i l’obtenció de fluoròfors amb la propietat de suportar diversos cicles d’emissió fluorescent (Dickson et al., 1997) obrí la possibilitat d’aplicar aquestes tècniques a qüestions obertes de la biologia molecular. Betzig et al. (2006) empraren la microscopia de localització activada (PALM) en 1) detectar la posició de la vinculina en adhesions focals, 2) detectar la posició de l’actina en un lamel·lipodi, 3) descriure la distribució de la proteïna retroviral Gag en la membrana plasmàtica d’una cèl·lula infectada. Hom ja no es limitava a la subestructura que evidencia la microscopia electrònica, sinó que començava a acaronar la infrastructura molecular de la cèl·lula i, a més, d’una cèl·lula viva.

Aquesta entrada ha esta publicada en 6. La Civilització. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

Aquest lloc utilitza Akismet per reduir el correu brossa. Aprendre com la informació del vostre comentari és processada