Aquest text es publicà el 5 de febrer del 2020. Fou esborrat el mes d’abril per raons desconegudes, de manera que el torno a publicar
Virologia: Cada any moren 770.000 persones com a conseqüència de la síndrome d’immunodeficiència adquirida (SIDA). Aquesta malaltia resulta de la depleció selectiva de limfòcits T CD4+, deguda a la infecció per un dels dos virus de la immunodeficiència humana (HIV-1 i HIV-2). Cada any, hi ha 1.700.000 casos nous d’infecció per HIV. Globalment, la població infectada és de 38 milions de persones. La teràpia antiretroviral altament activa (HAART) alenteix el progrés de la infecció i la transmissibilitat, i manté els nivells de limfòcits T. Sense tractament, hi ha una considerable variabilitat en el curs de la infecció, des de casos de progressions ràpides fins a situacions de control espontani. No obstant, tan sols una petita fracció de les persones infectades per HIV-1 controlen espontàniament la replicació del virus fins a fer-lo indetectable en la sang (amb nivells de menys de 50 còpies/ml). Hom anomena aquestes persones infectades “controladors d’elit”, però aquesta situació no sempre es manté en el temps. Un grup d’investigadors coordinat per Ezequiel Ruiz-Mateos (del Instituto de Biomedicina de Sevilla), María Salgado (de l’Institut de Recerca de la Sida, IrsiCaixa), Javier Martinez-Picado (IrsiCaixa) i Cecilio Lopez-Galindez (del Centro Nacional de Microbiología de l’ISCIII) defineix com a “controladors d’elit excepcionals” aquelles persones infectades per HIV-1 que, sense rebre antiretrovirals, mantenen la virèmia de manera permanent a nivells indetectables durant més de 25 anys. En un article a Scientific Reports ens presenten tres casos que entren en aquesta definició, persones diagnosticades de la infecció per HIV-1 entre el 1988 i el 1992, que mai no han mostrat signes de malaltia clínica sense haver rebut mai cap tractament antiretroviral. Val a dir que aquestes tres persones presenten tres o més al·lels protectors front a la infecció de l’HIV-1. La presència d’ADN retroviral és molt baixa (menys de 20 còpies per cada milió de limfòcits T CD4+), com també la producció de virus competents (menys de 0,025 unitats infeccioses per milió de limfòcits T CD4+). Bona part dels genomes vírics presents en aquests pacients són defectius, i mostren una escassa diversitat genètica en el gen env (<0,01 substitucions per nucleòtid). A més, es registra una forta resposta immune cel·lular específica contra l’HIV-1. Els nivells inflamatoris d’aquests pacients són equivalents als d’una persona seronegativa. Aquests tres pacients constituirien, doncs, casos de guariment funcional espontani del VIH-1. És un guariment funcional en el sentit que encara són infectats, però és justament el manteniment d’un reservori viral no-funcional i sense capacitat d’evolució genètica, juntament amb el manteniment d’una resposta immunitària específica contra l’HIV-1 (que inclou la pròpia seropositivitat) les claus que explicarien aquests tres casos excepcionals.
Els tres casos identificats (EEC-3, EEC-9 i EEC-56) mostren una infecció per HIV-1 controlada, en termes de càrrega viral i de comptatge de limfòcits T CD4+
Guarir la infecció per HIV
Aquest estudi fou dissenyat per Concepción Casado (del Servicio de Virología Molecular i del Laboratorio de Referencia e Investigación en Retrovirus, del Centro Nacional de Microbiología, del Instituto de Salud Carlos III, a Majadahonda), Maria Pernas (ISCIII), Carmen Rodriguez (del Centro Sanitario Sandoval, IdISSC), Jorge Del Romero (IdISSC), Ezequiel Ruiz-Mateos (de la Unidad Clínica de Enfermedades Infecciosas, Microbiología y Medicina Preventiva del Instituto de Biomedicina de Sevilla, IBiS-CSIC), Javier Martinez-Picado (IrsiCaixa) i Cecilio Lopez-Galindez (ISCIII).
Les dades foren recollides per Casado, Cristina Galvez (IrsiCaixa), Pernas, Laura Tarancon-Diez (IBiS), Rodriguez, Víctor Sanchez-Merino (de la Unidad de Inmunopatología del SIDA del CNM-ISCIII), Mar Vera (IdISSC), Isabel Olivares (ISCIII), Rebeca De Pablo-Bernal (IBiS), Alberto Merino-Mansilla (ISCIII), Ramon Lorenzo-Redondo (de la Division of Infectious Diseases de la Northwestern University Feinberg School of Medicine, de Chicago), Ruiz-Mateos i María Salgado (IrsiCaixa). L’anàlisi de dades fou realitzada per Casado, Galvez, Pernas, Tarancon, Rodriguez, Sanchez-Merino, Vera, Olivares, De Pablo, Merino, Lorenzo, Ruiz-Mateos i Salgado. La interpretació de les dades la feren Casado, Pernas, Lorenzo, Ruiz-Mateos, Salgado, Martinez-Picado i Lopez-Galindez.
La recerca en el Centro Nacional de Microbiología, que comptà amb el suport tècnic de Rosa Fuentes, fou finançada per ajuts del Ministerio de Economía y Competividad, del Instituto de Salud Carlos III i de Fons Europeus per al Desenvolupament Regional. Part de la feina de l’IBiS rep ajuts de la Consejería de Salud y Bienestar Social de la Junta de Andalucía. La feina a l’IrsiCaixa es finançà en part amb ajuts de la companyia farmacèutica Grifols.
La redacció de l’article fou a càrrec de Casado, Pernas, Olivares, Lorenzo, Ruiz-Mateos, Salgado, Martinez-Picado i Lopez-Galindez. Els autors agraeixen a Andreas Meyerhans i Rowena Johnston, d’amfAR, la lectura crítica que en feren. L’article fou rebut el 29 d’octubre del 2019, i Scientific Reports l’acceptà el 27 de desembre, i el publicà el 5 de febrer del 2020.
El primer agraïment dels autors és a les tres persones infectades “per la llur contribució contínua i generosa”.
Aquestes tres persones no han rebut fàrmacs antiretrovirals. La teràpia combinada d’antiretrovirals (ART, en l’acrònim anglès) aconsegueix efectivament dur els nivells vírics en la sang (virèmia) a valors indetectables, la qual cosa també estronca la capacitat de transmetre el virus a altres persones. A mitjans dels 1990, hom pensà que la teràpia antiretroviral combina podia ser capaç fins i tot d’eliminar completament la infecció… Però l’HIV és un lentivirus, d’infecció molt persistent, i alguns estudis calculen que caldria un tractament sostingut de vora 70 anys per eliminar-lo. L’objectiu final d’erradicar tota forma viral infecciosa sembla fora de l’abast de l’arsenal terapèutic existent, encara que el transplantament al·logènic de cèl·lules mare hematopoiètiques ha conduït en dos casos a l’erradicació efectiva de l’HIV-1 quan aquesta teràpia tan agressiva era indicada davant d’una greu malaltia hematològica. Per al guariment funcional de la infecció, segons sostenen Casado et al., n’hi hauria prou amb la supressió permanent de la replicació de l’HIV-1 en absència d’ART.
Un exemple de guariment funcional el constitueixen els anomenats “controladors d’elit”, és a dir la minoria de persones infectades per HIV que mantenen la virèmia sota nivells indetectables malgrat no rebre teràpia antiretroviral. Aquest estatus, però, no sempre es manté a llarg termini. Casado et al. consideren que els més s’acosten al guariment funcional són els que mantenen aquesta situació de forma indefinida. Els “controladors d’elit excepcionals” mantindrien aquest control durant més de 25 anys.
Els tres casos de “controladors d’elit excepcionals” que presenten Casado et al. van rebre el diagnòstic de la infecció fa 25, 28 i 29 anys respectivament. Des de llavors han rebut un seguiment extensiu, que ha constatat un control permanent espontani de la replicació viral i l’absència de qualsevol signe de progressió de la malaltia. Conèixer els factors genètics, immunològics i virològics d’aquests tres casos excepcionals ajudaria a identificar marcadors més definitoris d’aquesta condició i, alhora, a conèixer possibles dianes terapèutiques que facin possible el guariment funcional també en altres casos.
Una exploració virològica, immunològica i genètica
Casado et al. (2009) investigaren en una cohort de 64 persones infectades per HIV que no havien estat tractades amb antiretrovirals els factors genètics (tan virals com humans) que modulaven la progressió de la malaltia. Una part d’aquestes persones eren visitades pel Centro Sanitario Sandoval, centre d’assistència primària vinculat a l’IMSALUD a través del Hospital Clínico San Carlos). Per a aquest estudi se seleccionaren tres persones de les que més temps portaven en aquesta situació de control espontani de la infecció.
Les tres persones havien estat diagnosticades per HIV amb un ELISA de segona generació confirmat per Western Blot, cinc o sis anys després de la data estimada d’infecció. Com en l’estudi interior, els tres participants donaren el consentiment informat pels estudis moleculars i genètics. L’estudi havia rebut l’aprovació prèvia del Comitè Ètic de l’Instituto de Salud Carlos III i del Comitè de Recerca Clínica del Hospital San Carlos. Els autors de l’estudi agraeixen la feina realitzada pel doctor Vicente Estrada i l’equip d’infermeria del Departamento de Enfermedades Infecciosas del Hospital Clínico San Carlos.
El març del 2017, a cadascun dels tres participants se’ls extragué 500 mL de sang, amb l’assistència de Lucia Perez-Alvarez i Angel Pajares Herraiz (metges del Hospital Virgen de la Salud de Toledo).
Part de les proves microbiològiques foren realitzades per Águeda Hernández Rodríguez, Belén Rivaya i Victoria González Soler, del Departament de Microbiologia de l’Hospital Germans Trias i Pujol. El reservori proviral total fou quantificada per cada pacient en dues mostres, la del 2017, i una anterior (feta 11 o 13 anys abans). Això es quantifica a través d’un extracte purificat de limfòcits T CD4+, que són lisats i sotmesos a una amplificació selectiva d’ADN de HIV-1 (de les regions 5-LTR i gag), emprant l’amplificació gen RPP30 com a referent. En cada rèplica s’analitzen 1,5-1,8 milions de cèl·lules, i hom pot arribar a detectar-hi la presència d’una a tres còpies per cada milió de cèl·lules.
Per valorar el reservori viral capaç de replicar-se s’utilitza un assaig qVOA. En aquest cas, la mostra inicial són de 28 a 63 milions de cèl·lules T CD4+, de les que es fa un cultiu primari. Al 14è dia del cultiu, es recupera el sobrenedant i hom assaja per enzimoimmunoassaig la presència de la proteïna viral p24Gag.
La càrrega viral plasmàtica es determina d’acord amb la presència de l’ARN de l’HIV-1. Per determinar la virèmia residual s’utilitzen 9 mL de plasma, que són ultracentrifugats, per fer després una detecció d’ARN que té la capacitat de detectar fins a 0,5 còpies/mL.
La transcripció viral dins de cèl·lules s’estima en limfòcits T CD4+ amb una RT-PCR sobre les regions 5-LTR i gag (amb una RT-PCR de l’ARNm del gen TBP com a referent). En cada rèplica entren 3-5 milions de cèl·lules, i s’hi pot arriba a detectar 0,03-0,05 còpies de l’ARN viral respecte l’ARNm del gen TBP.
El gen env del virus fou seqüenciat en un fragment C2-V5 de 614 parells de nucleòtids. També s’obtingueren seqüències gairebé completes del genoma viral. Les seqüències obtingudes foren publicades en el GenBank.
Per a l’anàlisi de diversitat genètica del virus es van fer servir de referències seqüències de HIV Databases.
Les respostes immunes de cada pacient foren assajades ex vivo en cèl·lules mononuclears de sang perifèrica. També se sotmeteren limfòcits T CD4+ dels pacients a una infecció experimental amb les soques HIV-1NFN-SX i HIV-1NL4-3. En les mostres de plasma es mesuraren els nivells de proteïna C-reactiva (hsCRP), de β2-microglobulina, de D-dímer, d’interleucina-6 i de sCD163. També en plasma (en la mostra del 2017 i en un altra de 14-19 anys abans) es mesuraren els nivells d’anticossos anti-HIV-1.
Els canvis de virèmia al llarg del temps foren analitzats estatísticament amb un test Wilcoxon. La poli-funcionalitat de la resposta específica dels limfòcits T a la proteïna Gag fou analitzada segons el test de Martin Larson.
La clínica d’EEC-3, EEC-9 i EEC-56
Els tres individus d’aquest estudi són presentats de manera anònima com a EEC-3, EEC-9 i EEC-56 (EEC són les sigles d’excepcional elite controller):
– EEC-3 és un home nascut el 1956. Es degué infectar pel HIV-1 pels volts del 1983, i la infecció li fou diagnosticada el 1988. El 1996 se li diagnosticà infecció pel virus de l’hepatitis C (HCV), pel qual el 2008 rebé un tractament de RBV/IFNα.
– EEC-9 és una dona nascuda el 1957. Es degué infectar pel HIV-1 pels volts del 1986, i la infecció li fou diagnosticada el 1992, juntament amb una infecció per HCV. De la infecció per HCV es guarí espontàniament. Ha tingut un fill seronegatiu.
– EEC-56 és una dona nascuda el 1957. Es degué infectar pel HIV-1 pels volts del 1984, i la infecció li fou diagnosticada el 1989. El 1993 se li diagnosticà una infecció per HCV, per la qual fou tractada el 2017 amb DAA. Ha tingut un fill seronegatiu.
En tots tres casos la via de contagi de l’HIV fou compartir xeringues intravenoses, que també fou la via de contagi de l’HCV. Des del diagnòstic no han presentat mai nivells detectables de càrrega viral, excepte EEC-9 en dues ocasions al principi. També han mantingut estables els nivells de limfòcits T CD4+ o CD8+. Clínicament pertanyen a l’estatus A (asimptomàtic). És per això que no han rebut mai teràpia antiretroviral.
Genèticament, els tres pacients presenten al·lels associats a la protecció davant l’HIV, com ara l’HLA-B*57:01, l’HLA-B*58:01, l’HLA-B*27:05 o l’HLA-B*14:02; la mutació T>C (rs9264942) del gen HLA-C en homozigosi; o variants dels gens CCR5 i CCR2 que dificulten la infecció.
Els nivells d’ADN d’HIV-1 en cèl·lules T CD4+ van de les 9,1 còpies a les 23,0 còpies per cada milió de cèl·lules. Són nivells detectables, però extremadament baixos. Un nivell similar es detecta en les mostres de plasma congelat de fa 11-13 anys.
L’assaig qVOA permet identificar quina fracció l’ADN viral té capacitat per replicar-se. En cap dels tres casos s’hi detecten virus competents, de manera que els valors d’unitats infeccions per milió de cèl·lules ha de ser inferior a 0,025.
Els nivells d’ARN d’HIV-1 en el plasma són indetectables per a EEC-3 i EEC-56. En el cas d’EEC-9 s’hi detecten 2 còpies per mL de plasma.
Els nivells d’ARN d’HIV-1 en cèl·lules T CD4+ de sang perifèrica són indetectables en els tres casos.
La genètica de l’HIV-1 en aquests tres pacients
La comparació de les mostres del 2017 amb les obtingudes durant els 15 anys previs permet seguir l’evolució de la població viral d’aquests tres pacients:
– per a EEC-3 s’han obtingut 86 seqüències del gen env corresponents a 7 punts temporals d’un interval de 14 anys.
– per a EEC-56 s’han obtingut 94 seqüències del gen env corresponents a 9 punts temporals d’un interval de 19 anys.
– per a EEC-9 s’han obtingut 2 seqüències gel den env per a cinc punts temporals d’un interval de 15 anys.
El gen env codifica per a la proteïna de l’embolcall, que té un rol central en l’entrada de la partícula vírica a la cèl·lula hoste. Les seqüències dels tres pacients indiquen que es tracta d’una variant d’HIV-1 que utilitza la proteïna CCR5 com a coreceptor.
De les 182 seqüències recuperades del gen env només hi ha dues hipermutades, corresponents a una mostra d’EEC-3. Aquesta baixa diversitat del gen env és un dels trets que explicaria el control excepcional de la infecció.
És a través d’aquestes seqüències que Casado et al. fan l’estimació del moment de la infecció dels tres individus. Les dates calculades, com hem vist, van del 1983 al 1986, de manera que en el moment de l’anàlisi del 2017 havien passat més de 30 d’anys d’infecció.
Casado et al. feren 337 intents d’amplificació del genoma viral a partir de cèl·lules dels pacients. Tan sols aconseguiren 11 amplificacions, 9 d’EEC-3, 1 d’EEC-9 i 1 d’EEC-56. D’aquests 11 amplificacions, tan sols 1 d’EEC-3 fou completa (inclosa en GeneBank en l’entrada MN055643). Aquest genoma mostra una mutació G>A en la posició 290, que afecta la funció d’splicing i deixa molt malmesa la capacitat replicativa del virus. Les altres seqüències obtingudes mostren delecions importants, particularment en els gens pol (el que codifica per la retrotranscriptasa) i env. És un indici que en els tres pacients la majoria de provirus són defectius.
Anàlisi filogenètica dels virus trobats en els tres pacients en mostres de diferents èpoques. La diversitat és baixa, de vora 0,01 substitucions per nucleòtid al llarg de 15 anys.
La resposta immunitària
L’exposició de limfòcits T CD8+ a la proteïna Gag és un indicador de resposta específica a l’HIV-1. Els limfòcits que reconeixen aquest antigen hi responen amb la producció de citocines (TNFα, IL-2, IFNγ). És possible diferenciar també els limfòcits que hi participen entre els responsables de la memòria immunitària central, la memòria efectora i els diferenciats terminalment. L’alliberament de múltiples citocines és un indici de poli-funcionalitat. Els tres individus amb un control excepcional de la infecció mostren respostes cèl·lules específiques més fortes i més poli-funcionals.
In vitro, les cèl·lules T CD4+ dels pacients són susceptibles a infecció per HIV-1. Ara bé, si hom afegeix a aquesta infecció experimental cèl·lules T CD8+ del mateix pacient, hi ha una reducció significativa de la replicació viral. Sembla doncs, que és la resposta immune dels T CD8+ i no una propietat intrínseca dels T CD4+ la que manté el control de la infecció en aquests pacients.
Els comptatges de cèl·lules mieloides, indiquen que els tres pacients mantenen uns bons nivells de cèl·lules dendrítiques mieloides, incloses les poblacions CD1c+ i CD141+.
Pel que fa als biomarcados d’inflamació, els tres pacients presenten nivells baixos d’hsCRP, de β2-microglobulina i de D-dímer. Sí que són més elevats els nivells d’IL-6 i sCD163, cosa que Casado et al. atribueixen al historial previ d’HCV o bé a la presència residual d’antígens d’HIV.
Els tres pacients presenten nivells detectables d’anticossos contra les tres proteïnes retrovirals. Ara bé, aquests nivells d’anticossos són inferiors als d’altres persones infectades per HIV.
Diversos factors contribueixen a un control espontani excepcional de la infecció
En aquests tres casos coincideixen un reservori viral poc divers i poc competent, amb factors genètics protectors i respostes immunitàries efectives. Els nivells de reservori viral en cèl·lules T CD4+ són 50 vegades inferiors als que s’aconsegueix amb la teràpia antiretroviral. Els valors de virèmia també són inferiors al d’altres persones amb infeccions controlades espontàniament.
La manca d’evolució en el gen env indica que probablement en aquests individus no hi ha hagut replicació viral durant més de tres dècades d’infecció. Els pocs genomes vírics presents haurien experimentat una expansió clonal a través de les cèl·lules immunes infectades, però això alhora comportaria una major exposició al sistema immune. Paral·lelament, s’haurien acumulat mutacions detrimentals en aquests genomes vírics, reduint encara més la capacitat de replicació. Casado et al. creuen que la diversitat genètica vírica pot servir de marcador per estimar la probabilitat que una persona amb infecció controlada espontàniament retingui aquest control o el perdi.
Aquests pacients tenen ara més de 60 anys. En un dels casos, comença a haver-hi un declivi dels nivells de T CD4+ atribuïble a l’edat. Casado et al. consideren que som davant d’un model de guariment funcional espontani de la infecció per HIV-1. Aquest model indica que les estratègies terapèutiques haurien de combinar esforços cap a la reducció dels reservoris latents d’HIV-1, cap a la reducció de la diversitat viral i cap a l’estimulació de respostes immunes específiques contra l’HIV-1.
Lligams:
– Permanent control of HIV-1 pathogenesis in exceptional elite controllers: a model of spontaneous cure. Concepcion Casado, Cristina Galvez, Maria Pernas, Laura Tarancon-Diez, Carmen Rodriguez, Víctor Sanchez-Merino, Mar Vera, Isabel Olivares, Rebeca De Pablo-Bernal, Alberto Merino-Mansilla, Jorge Del Romero, Ramon Lorenzo-Redondo, Ezequiel Ruiz-Mateos, María Salgado, Javier Martinez-Picado & Cecilio Lopez-Galindez. Scientific Reports 10: 1902 (2020).
