De la mutació (P553T de la GluN2B del receptor NMDAR) al tractament (suplementació alimentària de L-serina)

Neuromedicina: Fa uns anys arribà a l’Hospital Sant Joan de Déu una nena d’1 any d’edat amb endarreriment psicomotor i hipotonia severa (no podia mantindre el cap dret ni seure dreta), amb un comportament absent i estereotípies com fregar-se les mans. Els símptomes indicaven que es tractava d’un cas de síndrome de Rett, una malaltia rara (amb una incidència en noies d’1 cas de cada 10.000 naixements) de base genètica. A 2 anys i mig, la nena es mostrava menys irritable i ja podia mantindré el cap dret. A 3 anys i mig, un electroencefalograma mostrava alteracions epileptiformes de l’activitat cerebral, per la qual cosa se la tractà primer amb àcid valproic i després amb levetiracetam. A 5 anys i 10 mesos, el test de Vineland indicava que encara tenia una edat mental inferior a 1 any. En un article a Science Signaling un grup de metges i investigadors ens expliquen la feina realitzada a partir de llavors per precisar l’etiologia genètica i molecular del trastorn d’aquesta nena. Identificaren la mutació responsable (el canvi de la prolina en posició 553 de la subunitat GluN2B del neuroreceptor NMDA per una treonina). En un cultiu neuronal veieren que els efectes d’aquesta mutació sobre el NMDAR podien contrarestar-se amb D-serina, un agonista d’aquest receptor. Així doncs, es dissenyà un tractament que fes elevar els nivells de D-serina en el plasma i el líquid cefalorraquidi de la pacient: ho feren a través d’una suplementació de L-serina en pols en aliments o begudes. En l’article exposen els resultats després de més d’un any de tractament: s’hi han registrat millores en la capacitat motora, cognitiva i comunicativa de la pacient.

La caracterització biofísica de les propietats de canal del receptor NMDA amb la mutació present en la nena de 5 anys fou crucial per identificar el possible rol compensador de la D-serina

Un exemple de recerca biomèdica translacional i personalitzada

La síndrome de Rett i altres encefalopaties constitueixen un exemple d’alteració congènita del metabolisme. Les alteracions congènites del metabolisme són habitualment classificades entre les “malalties rares”, en el sentit que la base subjacent és una mutació disruptora que pot variar de família en família, i fins i tot de pacient en pacient. Això comporta que siguin malalties “orfes”, poc investigades, una manca de recerca que es fa més dramàtica davant de l’absència de tractaments específics. És per això precisament que aquesta recerca és un exemple valuós de la potencialitat d’una perspectiva translacional i personalitzada de la recerca biomèdica en aquests casos.

L’estudi en qüestió fou dissenyat per Xavier Altafaj, de la Unitat de Neurofamarcologia i Dolor de l’Institut de Recerca Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL), en col·laboració amb la neuròloga Àngels García-Cazorla (del Servei de Genètica i Medicina Molecular i de la Unitat Neurometabòlica de l’Hospital Sant Joan de Déu), David Soto (de l’Institut de Neurociències de la Universitat de Barcelona i de l’Institut de Recerca Biomèdica August Pi i Sunyer, IDIBAPS), Mireia Olivella (del Grup de Bioinformàtica i Estadística Mèdica de la Universitat de Vic), Xavier Gasull (de l’Institut de Neurociències de la UB i de l’IDIBAPS) i Carlos Sindreu (de l’Institut de Neurociències i del Departament de Bases Clínies de la UB). En els registres electrofisiològics participaren Soto, Gasull, Roberto García-Díaz i Esther Gratacòs-Batlle (tots ells de l’Institut de Neurociències i de l’IDIBAPS). Olivella desenvolupà el model estructural i realitzà l’anàlisi bioinformàtica. L’anàlisi filogenètic fou a càrrec d’Àlex Bayés i David Ramos Vicente, del Laboratori de Fisiologia Molecular de la Sinapsi de l’Institut de Recerca Biomèdica Sant Pau (adscrit a la UAB). L’anàlisi de la potenciació de llarg termini el dugueren a terme Sindreu, Clara Alcon (Institut de Neurociències), Cristina Grau (IDIBELL) i Macarena Gómez de Salazar (IDIBELL). Grau, Ana Santos-Gómez i Sílvia Locubiche feren les anàlisis morfològiques a l’IDIBELL. Els estudis lipidòmics els realitzaren Emeline Chu-Van i Benoit Colsch, del Service de Pharmacologie et d’Immunoanalyse (SPI) del Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Medicaments, de Gif-sur-Yvette. Anna López-Sala, del Departament de Neurologia de la Unitat Neurometabòlica de l’Hospital de Sant Joan de Déu va fer els reconeixements de comportament de la pacient. Els estudis farmacològics foren duts a terme per Víctor Fernández-Dueñas i Francisco Ciruela, de l’IDIBELL. Judith Armstrong, de l’Hospital Sant Joan de Déu, va generar i validar les dades genètiques. La part clínica de l’estudi fou coordinada per García-Cazorla.

Altafaj redactà l’article, amb l’ajut de García-Cazorla, Soto i Olivella. Cal considerar Soto, Olivella i Grau com els primers autors. Com a autors corresponsals amb la revista actuaren García-Cazorla i Altafaj. Els autors reconeixen la col·laboració de N. Verhoeven, J. Gerrits, R. Artuch i A. Ormazábal en les mesures analítiques d’aminoàcids en fluids corporals. També agraeixen a S. Jurado, de l’Institut de Neurociències d’Alacant, el guiatge en els experiments de potenciació química a llarg termini dels neuroreceptors. A P. Paoletti, de l’ENS de París, li agraeixen l’aportació dels plàsmids necessaris per als estudis dels neuroreceptors. Aquesta recerca fou finançada amb diversos projectes del Fons Europeu de Desenvolupament Regional, la Marató, el Programa Miguel Servet, etc.

Si bé inicialment, la nena fou diagnosticada amb la síndrome de Rett, es tractaria d’una síndrome de Rett atípica. Concretament, hi hauria una afectació del receptor de glutamat NMDA (anomenat així perquè té com a agonista el N-metil-D-aspartat). NMDAR és un neurotransmissor de sinapsis glutamaèrgiques (en general, excitadores) del sistema nerviós central. NMDAR compleix un paper crític en la neurogènesi (formació de neurones), la sinaptogènesi (formació de sinapsis, és a dir de connexions interneuronals) i els processos de plasticitat sinàptica (que modifiquen les relacions entre neurotransmissors i receptors d’una sinapsi). NMDAR és una proteïna sinàptica heterotrimèrica, és a dir formada per tres subunitats diferents. Una d’aquestes subunitats pot ésser GluN2B, la qual s’expressa de manera més elevada durant el desenvolupament primerenc. El gen de la GluN2B és el gen GRIN2B. En aquest cas, la mutació es trobava en el gen GRIN2B. Es tracta d’una mutació que comporta la substitució de la prolina en la posició 553 de la proteïna per una treonina. Aquesta mutació provoca una menor resposta dels receptors NMDA al glutamat, i és la base de la severa encefalopatia que caracteritza aquest cas. Els estudis funcionals mostraven que la resposta dels receptors millorava amb la presència de D-serina. La D-serina és un dels exemples de D-aminoàcids que apareixen en el metabolisme, encara que ho fan de manera molt més minoritària que els seus isòmers L-aminoàcids, que són els que s’incorporen a les proteïnes. La D-serina és un coagonista de NMDAR. Així doncs, hipotetitzaren que l’elevació dels nivells de D-serina en el fluid cerebrospinal (=cefalorraquidi) podrien millorar la condició de la nena. Optaren per una suplementació en la dieta de L-serina que, metabolitzada en part a D-serina, elevà efectivament els nivells d’aquest D-aminoàcid en el plasma i en el líquid cerebrospinal de la nena després d’11 i de 17 mesos de tractament. El tractament s’associà amb beneficis terapèutics.

Metolodogia

Els pares de la nena atorgaren el consentiment informat de tots els aspectes d’aquest estudi. L’avaluació de la nena es fa a través d’una entrevista semiestructurada VABS-II, realitzada per un neuropsicòleg. VABS-II valora quatre dominis del comportament adaptatiu: comunicació, destreses quotidianes, socialització i destreses motores. El VABS-II fou realitzat a la nena quan tenia 5 anys i 10 mesos. Poc després inicià la suplementació amb L-serina, i als 11 mesos (quan tenia 6 anys i 9 mesos) i als 17 mesos (quan tenia 7 anys i 3 mesos) se li tornà a realitzar el VABS-II.

La suplementació amb L-serina començà amb 250 mg/kg diaris. A les quatre setmanes, hom comprovà la manca d’efectes no-desitjats, i s’apujà la suplementació a 500 mg/kg diaris. La suplementació es divideix en tres racions diàries, i consisteix en barrejar pols de L-serina amb els àpats o amb les begudes.

Per fer el diagnòstic genètic, quan la nena tenia 5 anys i 10 mesos, es realitzà una seqüenciació general de regions codificants. Alhora, la mateixa prova genètica es feia a la mare i al pare. Les seqüències obtingudes foren comparades amb la base de dades GRCh37, per tal d’identificar variants mononucleotídiques i delecions. Així es van identificar mutacions presents en la nena de nova aparició, és a dir que no fossin presents en els pares. Fou així com es trobà la mutació Pro553Thr del gen GRIN2B. L’impacte de la mutació fou valorat en models bioinformàtics (SIFT, PolyPhen-2, PROVEAN, MutationTaster2). Després es construí un model de receptor NMDA (GluN1)2-(GluN2B)2 en membranes de 1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfocolina, amb l’ús de plàsmids d’expressió de GLuN1 i d’una GluN2B marcada amb un gen de fluorescència (GFP). La mutació P553T fou reproduïda en aquests plàsmids amb el kit de mutagènesi QuikChange. Emprant bases de dades genètiques, es realitzà una anàlisi filogenètica del domini de GluN2B que conté la posició 553.

En un model de cèl·lules HEK-293T es feren experiments de co-immunoprecipitació per veure si la mutació P553T alterava l’afinitat de la GluN2B per acomplexar-se amb GluN1 i GluN2A. També s’emprà un model de cèl·lules COS-7 per assolir l’expressió de NMDAR amb la mutació.

El model neuronal es va realitzar en cultius de neurones hipocampals d’embrions de ratolí. Aquestes neurones eren transfectades amb els diferents constructes genètics d’interès. S’hi feren anàlisis morfològiques sobre l’arborització dendrítica i la formació d’espines. També s’hi realitzaren estudis de potenciació química de llarg termini.

La mutació P553T de la proteïna GluN2B

La seqüenciació global d’exomes de la nena i dels seus pares identificà una mutació que, absent tant en el pare com en la mare, havia aparegut en el genoma de la nena. Es tractava d’un canvi en el gen GRIN2B que comportava en el seu producte gènic, la proteïna GluN2B, la substitució de la prolina en posició 553 per una treonina. La proteïna GluN2B és una de les subunitats del receptor glutamaèrgic NMDAR.

La posició 553 de GluN2B es localitza al començament la primera hèlix transmembrana (M1). La prolina en aquesta posició té el paper de delimitar aquesta regió M1. Alhora la prolina553 interactua amb la fenilalanina653 (que es troba en la regió M3) de la mateixa cadena polipeptídica. La Pro553 també interactua amb la Phe654 de la GlunN1. Els models estructurals feien preveure que la substitució d’aquesta prolina per una treonina canviarien la permeabilitat del canal associat a NMDAR. Així doncs, la base molecular del trastorn de la nena seria una canalopatia.

La importància de Pro553 en GluN2B es manifesta en el seu grau notable de conservació en els genomes de metazous. De fet la Phe653 de GluN2B i la Phe654 de GluN1 fan part del motiu SYTANLAAF, la seqüència més altament conservador entre els receptors ionotròpics de glutamat (iGluRs). Dels 147 iGluRs de metazous analitzats, en 144 s’hi manté la posició Pro553.

En el model de transfecció de cèl·lules HEK 293T (línia derivada de ronyó d’embrió humà), la mutació P553T no sembla afectar la interacció de GluN2B ni amb GluN1 ni amb GluN2A. En el model de transfecció de cèl·lules COS-7 (derivades de fibroblasts de ronyó de mico), la mutació P553T no afecta el transport dels complexos de GluN2B amb GluN1 i GluN2A fins a la membrana citoplasmàtica. En el model de neurones corticals primàries de ratolí, la mutació P553T tampoc no afecta aquest transport.

En els experiments de “patch-clamp” en cèl·lules transfectades HEK 293T, sí que es notaven els efectes de la mutació. La mutació reduïa l’amplitud mitjançada per NMDAR en resposta a 1 mM de glutamat+50 µM de glicina. El canvi es devia a una alteració en la cinètica del canal iònic, amb una taxa de desactivació més ràpida i el consegüent augment de la taxa de dessensibilització. La conductància del canal era reduïda, com també ho era la probabilitat d’obertura. Així doncs, els receptors GluN1-GluN2B(P553T) es formen de manera correcta, i s’expressen correctament en la membrana citoplasmàtica, però són intrínsecament hipofuncionals.

Els heterotrímers (GluN1)2-GluN2A-GluN2B(P553T), en el model de cèl·lules HEK-293T, no mostraven una reducció en les amplituds de corrent en resposta a NMDA, però sí un augment de taxes de desactivació i de dessensibilització. Ara bé, en presència de 100 µM de D-serina hi ha una potenciació d’aquests heterotrímers. L’efecte de la D-serina també s’observava en els heterodímers GluN1-GluN2B(P553T), encara que sense restaurar-ne tota la funcionalitat. Si la D-serina actua com a coagonista en aquests canals, no passa el mateix amb la glicina.

En el model de neurones hipocampals primàries de ratolí, la sobreexpressió de GluN2B(P553T) produeix una reducció de la densitat d’espines. També es registra un augment de la subunitat GluA1 del receptor AMPA. Els experiments de patch clamp en aquestes neurones mostren que la GluN2B(P553T) comporta una disminució en l’amplitud de les corrents post-sinàptics excitatòries espontànies (EPSCs). Les EPSCs depenen dels NMDAR. Quan a aquestes neurones se les exposa a 100 µM de D-serina hi ha un augment en la freqüència d’EPSCs. La D-serina també és capaç de millorar la densitat d’espines i de restaurar l’abundància superficial de GluA1.

Els efectes bioquímics i clínics de la suplementació amb L-serina de la pacient

En un principi, les dades moleculars convidaven a provar una suplementació amb D-serina de la pacient. Però la D-serina no és un suplement aprovat, ja que existeixen alguns dubtes quant a la seva seguretat. En canvi, sí que és aprovat com a suplement l’ús de L-serina. Com que fisiològicament la L-serina és el precursor de la D-serina en l’organisme humà (a través de l’enzim serin-racemasa), calia pensar que la suplementació de la nena amb L-serina augmentaria els nivells de D-serina en el cervell.

La suplementació fou fixada en 500 mg diaris de L-serina per kg de pes corporal. Disset mesos després de l’inici d’aquesta suplementació, l’anàlisi del plasma per UPLC-MS/MS indicava un augment de 4,4 vegades dels nivells inicials de D-serina. Fou important constatar que els nivells de D-valina, D-isoleucina o D-leucina no foren afectats, com tampoc no ho foren els nivells de glicina, taurina i cisteïna.

L’augment de D-serina també es registrava en el líquid cerebrospinal.

En el moment de començar la suplementació, la nena tenia poca destresa comunicativa, una baixa tendència d’establir contacte visual, poca atenció a les activitats de pares, mestre o companys d’escola, cap ús del llenguatge verbal (ni en mots ni en sons), cap signe d’ús de joc simbòlic, i la incapacitat d’incorporar-se cap a una posició asseguda (si bé la podia mantindre amb suport previ). La puntuació del test de Vineland era de 42 en comunicació, 36 en destreses quotidianes, 49 en socialització i 31 en destreses motores.

A 11 mesos de l’inici del tractament, l’electroencefalograma no mostrava signes de millora. El test VABS indicava, però, una millora de la destresa motora (de 31 a 38), que es manifestava en la capacitat d’aixecar-se quan era asseguda, i fins i tot de caminar si rebia un ajut extern. Pel que fa a la comunicació, començava a fer gestos com el d’estendre les mans perquè l’agafessin, i presentava una major expressivitat facial. Quan la cridaven pel nom ja girava el cap, i havia millorat en contacte visual. Per primera vegada somreia de manera proactiva.

A 17 mesos del tractament, ja mostrava més interès en les cares i era capaç d’un contacte visual persistent. Ja seguia amb interès les activitats de la gent al seu voltant. Començava a riure davant de situacions divertides i semblava més feliç. Ja era capaç d’imitar sons de joguines i d’animals i d’anar pel terra de quatre grapes. Ja podia també desplaçar-se amb un caminador ortopèdic.

Per Soto et al. aquest és un exemple d’estudi que identificar la patogenicitat d’una mutació de NMDAR i que desenvolupa una estratègia terapèutica de precisió. La metodologia emprada és aplicable a trobar estratègiques terapèutiques per a altres casos d’alteracions congènites de la funció sinàptica. Que la suplementació amb L-serina sigui capaç de reforçar la neurotransmissió glutamaèrgica o de compensar ni que sigui parcialment el desequilibri entre neurotransmissors excitatoris o inhibitoris, és rellevant en el desenvolupament de tractament per a un ample espectre de trastorns neurològics, tan congènits com adquirits.

Lligams:

L-Serine dietary supplementation is associated with clinical improvement of loss-of-function GRIN2B-related pediatric encephalopathy. David Soto, Mireia Olivella, Cristina Grau5, Judith Armstrong, Clara Alcon, Xavier Gasull, Ana Santos-Gómez, Sílvia Locubiche, Macarena Gómez de Salazar, Roberto García-Díaz, Esther Gratacòs-Batlle, David Ramos-Vicente, Emeline Chu-Van, Benoit Colsch, Víctor Fernández-Dueñas, Francisco Ciruela, Àlex Bayés, Carlos Sindreu, Anna López-Sala, Àngels García-Cazorla, and Xavier Altafaj. Science Signaling 12 (586): eaaw0936 (2019)

Un tractament amb suplement dietètic millora la motricitat i comunicació d’una pacient amb síndrome de Rett atípica. Notícia d’Idibell.cat

Aquesta entrada ha esta publicada en 3. La Vida. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

Aquest lloc utilitza Akismet per reduir el correu brossa. Aprendre com la informació del vostre comentari és processada