L’evolució dirigida d’enzims i anticossos (Frances H. Arnold, George P. Smith, Gregory P. Winter; Premi Nobel de Química 2018)

Bioquímica: La Reial Acadèmia Sueca de Ciències ha fet públic els noms dels guardonats amb el Premi Nobel de Química del 2018. L’ha repartit en dues meitats de 4,5 milions de corones sueques cadascuna. La primera meitat ha correspost a Frances H. Arnold “per l’evolució dirigida d’enzims“. La segona meitat se la repartiran George P. Smith i Sir Gregory P. Winter “per l’exposició en bacteriòfags de pèptids i anticossos“.

Frances H. Arnold

Frances H. Arnold (*Edgewood, Pennsylvania, 25.7.1956) es graduà en enginyeria mecànica i aeroespacial a la Princeton University (1979). Es doctorà en enginyeria química a la University of California, a Berkeley, el 1985. És professora d’enginyeria química, bioenginyeria i bioquímica del California Institute of Technology, a Pasadena.

George P. Smith

George P. Smith (*Norwalk, Connecticut, 10.3.1941) es graduà en biologia al Haverford College. Es doctorà en bacteriologia i immunologia a la Harvard University el 1970, amb Edgar Haber de supervisor. Després d’una estada a la University of Wisconsin, esdevingué professor de ciències biològiques a la University of Missouri, a Columbia.

Gregory P. Winter

Gregory P. Winter (*Leicester, 14.4.1951) es graduà en ciències naturals a la University of Cambridge (1973). En el mateix centre es doctorà el 1977, amb una tesi sobre la seqüència aminoacídica de la triptofanil-ARNt-sintetasa de Bacillus stearo-thermophilus, supervisada per Brian S. Hartley i George Brownlee. Desenvolupà la seva carrera en el MRC Laboratory of Molecular Biology, a Cambridge. En el 1989 fundà la Cambridge Antibody Technology, que havia de traslladar els seus estudis sobre humanització d’anticossos monoclonals i sobre l’ús del fag filamentós com a vector d’expressió de fragments d’anticossos.

L’evolució dirigida d’enzims

En el 1984, Manfred Eigen teoritzà sobre un procediment d’evolució dirigida d’enzims. La combinació de genoteques, de diverses generacions de mutagènesi i de cribatge es constituïa en una “màquina evolutiva” per a l’optimització d’enzims d’acord amb un criteri preestablert. En el 1993, Chen & Arnold combinaren quatre rondes de mutagènesi aleatòria (amb l’ús de polimerasa de baixa fidelitat) i cribatge d’activitat per aconseguir una variant de la proteasa subtilisina E capaç de funcionar a concentracions elevades (60%) de dimetilformamida (Chen & Arnold, 1993) amb una activitat 256 vegades superior a la de l’enzim originari.

El laboratori d’Arnold aprofundí en les diverses passes d’aquesta tècnica d’evolució dirigida d’enzims:
1) identificar l’enzim adient per a la tasca que hom cerca.
2) construir una genoteca que cobreixi les parts més essencials del gen d’aquest enzim.
3) identificar els criteris de selecció que conduir a un enzim òptim per a la tasca que hom cerca.
4) a partir de les seqüències que compleixen millor els criteris de selecció, crear una nova genoteca que cobreixi parts addicionals del gen d’estudi.
5) establiment de criteris de selecció més exigents, i d’ací tornar a la passa 4 els cicles que convingui.

L’evolució dirigida d’enzims, com tot procés evolutiu, té com a matèria primera la variabilitat. El grup d’Arnold, doncs, va haver de dedicar esforços a tècniques de mutagènesi, fossin aleatòries o selectives. Miyazaki & Arnold (1999) constataren la dificultat que la mutagènesi puntual pogués produir substitucions aminoacídiques, com Pro/Ala, Pro/Val, Leu/Val o Trp/Ser, que requereixen dues o tres substitucions nucleotídiques en el codó corresponents.

Esquema l’evolució dirigida (cicle exterior) comparada amb l’evolució natural (cicle interior). La variabilitat és introduïda amb l’ús d’una polimerasa de baixa fidelitat, que produeix una mutagènesi aleatòria. La selecció es fa en un sistema d’expressió adequat, capaç de discriminar positivament les variants més favorables a la finalitat que es persegueix. Les variants desitjades seran les que entraran en un nova generació de mutagènesi, mentre que es descarten les altres

Un altre element de la tècnica és el procés selectiu. El grup d’Arnold treballà particularment en microorganismes que depenien per a la supervivència en un medi extrem del desenvolupament de l’activitat enzimàtica d’interès. Per exemple, per a l’obtenció d’una para-nitrobenzil-esterasa per a solvents aquo-orgànics, el cribatge de mutants es feien a través de la capacitat de metabolitzar l’antibiòtic loracarbef (Moore & Arnold, 1996). Per a l’obtenció d’una para-nitrobenzil-esterasa termostable, el cribatge es feia per la supervivència a diferents temperatures en un medi amb loracarbef (Giver et al., 1998)

L’evolució dirigida permeté a Giver et al., 1998 d’aconseguir, després de sis rondes de mutagènesi aleatòria, p-nitrobenzil-esterases amb una major termostabilitat. Així, mentre si l’enzim originaria perdia fortament activitat a temperatures superiors a 50ºC, la variant 6sF9, funcionava amb una alta activitat específica fins i tot a 60ºC

El grup d’Arnold ha demostrat que no tan sols hom pot aconseguir enzims que realitzen les seves funcions a temperatures o a altres condicions diferents de les naturals, sinó que també es pot aconseguir modificar la mateixa activitat enzimàtica. Herger et al. (2016) aconseguiren fer evolucionar la triptòfan-sintasa de Pyrococcus furiosus perquè generés un aminoàcid diferent, el beta-metil-triptòfan. Kan et al. (2016) feren evolucionar l’activitat d’inserció de carbè del citocrom c de Rhodothermus marinus fins a adquirir la capacitat de formar enllaços C-Si, amb una eficiència quinze vegades superior a la de catalitzadors industrials.

En l’actualitat, l’evolució dirigida d’enzims s’empra en el desenvolupament de biocatalitzadors més resistents o que realitzin noves funcions.

L’exposició en bacteriòfags de pèptids i anticossos

En el 1985, George P. Smith desenvolupà l’ús del bacteriòfag filamentós f1 com a vector d’expressió: els productes peptídics dels gens clonats eren expressats en la superfície de la partícula vírica en una proteïna de fusió (Smith, 1985). Això simplificava els protocols de cribatge de genoteques, ja que els productes gènics podien ésser identificats per la seva unió específica a receptors o a anticossos (Parmley & Smith, 1988).

Esquema d’una partícula vírica d’un fag filamentós (“Inovirus”). Aquests bacteriòfags infecten enterobacteris. En l’esquema s’assenyala de color blau la proteïna de coberta pIII, que és l’habitualment utilitzada en les tècniques d’exposició. A més tenim la pVI (bruna), pVII (vermella), pVIII (verda) i pIX (fúcsia). En porpre s’indica l’ADN monocatenari que constitueix el genoma d’aquest tipus de virus

Aquests vectors d’expressió foren emprats aviat per estudiar antígens de Plasmodium falciparum, l’agent de la malària. Scott & Smith (1990) mostraren que aquest sistema es podia fer servir per confegir “llibreries d’epitops”, és a dir llibreries de pèptids amb les quals es podia assajar l’especificitat d’anticossos. De manera semblant, les llibreries de pèptids podien servir per a la identificació de fàrmacs que s’uneixin específicament a seqüències aminoacídiques.

Protocol de selecció clonal en un fag filamentós com a vector d’expressió. La introducció d’una seqüència genètica en el genoma del fag filamentós fa que la seqüència peptídica corresponent sigui expressada en una de les proteïnes de càpside viral. Amb un ligand adequat hom pot seleccionar els fags filamentosos que expressen el pèptid desitjat amb un cicle de rentats

Un raonament invers va fer el grup de Gregory P. Winter, que utilitzà el fag filamentós com a vector d’expressió dels gens V d’anticossos (McCafferty et al., 1990). Mostraren que les seqüències proteiques expressades retenien l’especificitat de l’anticòs originari. Això obria la porta al disseny d’anticossos de major afinitat per a ligands específics.

La combinació de la tècnica d’exposició en bacteriòfags filamentosos i l’evolució dirigida s’ha utilitzat en el desenvolupament d’anticossos sintètics amb finalitats farmacològiques. El primer fàrmac aprovat que s’obtingué per aquesta via fou el adalimumab, un anticòs bloquejant de TNFα, que és efectiu en diferents malalties inflamatòries. Qui desenvolupà l’adalimumab fou la Cambridge Antibody Technology, de Greg Winter

Lligams:

Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. G. P. Smith Science 228: 1315-1317 (1985)

Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Stephen F. Parmley, George P. Smith. Gene 73: 305-318 (1988)

Searching for peptide ligands with an epitope library. J. K. Scott, G. P. Smith. Science 249: 386-390 (1990).

Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. John McCafferty, Andrew D. Griffiths, Greg Winter, David J. Chiswell. Nature 348: 552-554.

Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide. K. Chen, F. H. Arnold. PNAS 90: 5618-5622 (1993)

Directed evolution of a para-nitrobenzyl esterase for aqueous-organic solvents. Jeffrey C. Moore, Frances H. Arnold. Nat. Biotechnol. 14: 458-467 (1996).

Directed evolution of a thermostable esterase. Lori Giver, Anne Gershenson, Per-Ola Freskgard, and Frances H. Arnold. PNAS 95: 1280-12813 (1998).

Exploring nonnatural evolutionary pathways by saturation mutagenesis: rapid improvement of protein function. K. Miyazaki, F. H. Arnold. J. Mol. Evol. 49: 716-720 (1999)

Synthesis of β-Branched Tryptophan Analogues Using an Engineered Subunit of Tryptophan Synthase. Michael Herger, Paul van Roye, David K. Romney, Sabine Brinkmann-Chen, Andrew R. Buller, Frances H. Arnold. J. Am. Chem. Soc. 138: 8388-8391 (2016).

Directed evolution of cytochrome c for carbon–silicon bond formation: Bringing silicon to life. S. B. Jennifer Kan, Russell D. Lewis, Kai Chen, Frances H. Arnold 354: 1048-1051 (2016)

Aquesta entrada ha esta publicada en 6. La Civilització. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

Aquest lloc utilitza Akismet per reduir el correu brossa. Aprendre com la informació del vostre comentari és processada