La descoberta de les malacidines, una nova classe d’antibiòtics dependents de calci

L’augment de la prevalença de la resistència d’antibiòtics entre els microorganismes patògens, no compensada per una introducció suficient de nous antibiòtics, constitueix una preocupació sanitària global. La mortalitat per infeccions que no responen a cap tractament antibiòtic podria decuplicar-se en qüestió de tres dècades. La penicil·lina fou descoberta en el 1928 com a producte natural del metabolisme secundari de fongs del gènere Penicillium. En les dècades següents, el rastreig deliberat dels productes naturals de bacteris i fongs cultivats en el laboratori va permetre ampliar l’arsenal d’antibiòtics. Però aquest ritme de descoberta ha decaigut. Una alternativa seria cerca productes naturals de microorganismes que no s’hagin pogut cultivar mai en el laboratori. El grup de recerca de Sean F. Brady, de la Rockefeller University, ha desenvolupat en aquest sentit una plataforma de descoberta de productes microbians sense passar per cultiu, que explota eines de seqüenciació, anàlisi bioinformàtica i expressió dels gens detectats. És així com han descobert una família fins ara desconeguda de productes antibiòtics, que han denominat malacidines. La descoberta la comuniquen en un article publicat aquesta setmana a Nature Microbiology. El fet que les malacidines siguin calci-dependents, les fa un antibiòtic més focalitzat. L’aplicació farmacològica d’aquestes substàncies dependrà ara dels resultats d’ulteriors experiments. Però allò més important és que la plataforma del grup de Brady, juntament amb altres iniciatives, obra la porta a la detecció de metabolits microbians fins ara gairebé inaccessibles.

L’aïllament d’ADN ambiental de mostres de 2000 sòls dels 48 estats contingus dels Estats Units és el punt de partida d’una plataforma que clona aquest ADN, el seqüencia, el transfereix a un bacteri hoste i n’obté els productes naturals codificats per aquest ADN

Una plataforma de rastreig de la diversitat ambiental de productes naturals

La Plataforma “Environmental Surveyor of Natural Product Diversity” (eSNaPD) ha estat desenvolupada pel “Laboratory of Genetically Encoded Small Moleculecules“, de The Rockefeller University de Nova York. El director d’aquest laboratori és Sean F. Brady, que és alhora professor associat de la universitat.

Aquesta recerca fou dissenyada per Brady i per Bradley M. Hover, del mateix laboratori. La realització fou a càrrec de Hover, de Seong-Hwan Kim, Michah Katz, Jeremy G. Owen, Melinda A. Ternei, Jeffrey Maniko i Andreia B. Estrela, tots ells del laboratori de Brady, a més de Henrik Molina, del Proteomics Resource Center de la mateixa universitat. En l’anàlisi de les dades participaren Hover, Kim i Zachary Charlop-Powers (també del laboratori de Brady). Steven Park i David S. Perlin, del Public Health Research Institute de la Rutgers University, de Newark, ajudaren a emmarcar la recerca en les necessitats de la microbiologia mèdica. La redacció de l’article la feren Hover i Brady, que la trameteren a Nature el 15 de juliol del 2017. Després d’una revisió l’article fou acceptat el 3 de gener del 2018 i publicat el 12 de febrer.

Aquesta investigació fou finançada en part per la Gates Foundation i pel National Institute of Health (projecte NIH U19AI109713). Hover i Charlop-Powers reben ajuts del NIH. Brady, Hover, Katz i Charlop-Powers treballen, a més, per a Lodo Therapeutics. Lodo Therapeutics, una start-up creada per Brady i de la qual Hover n’és director associat, també rep suport financer de la Gates Foundation.

Del sòl a l’antibiòtic

Amb motiu d’aquesta recerca, el Laboratori de Brady incorporà a la seva col·lecció de 185 mostres de sòl unes 1800 addicionals. Aquesta decuplicació de la col·lecció la fa més representativa de la diversitat de sòls dels Estats Units d’Amèrica.

D’una alíquota de 25 grams de mostra de sòl fan una extracció d’ADN. En aquest ADN ambiental cerquen la presència de dominis d’adenilació (ADs) de pèptid-sintetases no-ribosomals (NRPS). Les NRPS són enzims de síntesi que produeixen pèptids com a via independent de la síntesi proteica ribosomal. Tots els antibiòtics dependents de calci coneguts (daptomicina, friulimicina, CDA, laspartomicina, A54145, taromicina) són sintetitzats per NRPS, i aquest és doncs el punt de partida de Hover et al. Així doncs utilitzen els encebadors corresponents a aquests AD (5′-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3′ i 5′-SASGTCVCCSGTSCGGTA-3′) per amplificar selectivament les mostres d’ADN ambiental (eDNA). Per a cada reacció d’amplificació necesiten uns 100 ng d’eDNA.

Els amplicons que resulten contenen seqüències potencialment vinculades a gens de síntesi de productes naturals són seqüenciats i analitzats bioinformàticament.

Paral·lelament, l’eDNA de cada mostra de sòl és clonat en llibreries de còsmids. Aquestes llibreries contenen fragments del metagenoma de cada mostra, incloses aquelles seqüències identificades bioinformàticament. Els clons de còsmids positius per a aquestes seqüències són seqüenciats per tal de recuperar els gens potencialment d’interès.

L’expressió heteròloga d’aquests gens es realitza primer en llevats, subclonant-los en un cromosoma bacterial artificial. Els constructes són després integrats en el cromosoma de Streptomyces albus J1074. Les espores dels bacteris així modificats genèticament són cultivades en un brou de soja.

Després de 14 dies de cultiu dels estreptomicets, se’n recupera el líquid de cultiu. Se’n fa una separació cromatogràfica, acoblada a una espectrometria de masses amb la finalitat de recuperar els metabòlits peptídics resultants. És així com s’aconseguí la separació de la malacidina-A i la malacidina-B.

L’estructura de les malacidines A i B fou estudiada per ressonància magnètica nuclear i per ionització d’elecrosprai. A través de la hidròlisi determinaren la configuració absoluta dels aminoàcids que integren les malacidines.

La susceptibilitat de bacteris patògens a les malacidines fou assajada en microplaques. Hom comparava aquesta susceptibilitat amb la daptomicina. També s’analitzava la susceptibilitat en absència o presència d’una suplementació de clorur càlcic (CaCl2), en absència o presència de sèrum boví fetal. Els bacteris estudiats foren una soca de tipus USA3000 del Staphylococcus aureus PFGE resistent a la meticil·lina (MRSA) i la soca TCH8431 de Streptococcus pneumoniae.

L’estudi de citotoxicitat de les malacidines es va fer amb les línies cèl·lulars HEK293 i MRC5. La HEK293 és una línia cel·lular derivada de ronyó embrionari humà (extret el 1973 d’un fetus legalment avortat als Països Baixos). La MRC5 és una línia derivada de fibroblasts pulmonars d’un fetus avortat el 1966. També feren un estudi d’activitat hemolítica in vitro.

La capacitat antibiòtica fou assajada en un model d’infecció cutània en rata produïda per la soca MW2 de MRSA.

En cultius de MRSA USA300 es va fer un assaig de resistència a les malacidines. Aquest assaig consisteix en una exposició continuada a malacidina-A i malacidina-B que seleccioni positivament bacteris resistents a aquests agents.

Quant al mecanisme d’acció de les malacidines, s’aplicà un assaig d’integritat de membrana en cultius de MRSA USA300. La integritat de membrana és assajada amb el colorant verd SYTOX.

Un altre assaig aplicat és el de l’acumulació UDP-MurNAc, que analitza possibles disfuncions de la síntesi de paret bacteriana. En aquest assaig, Hover et al. comptaren amb l’assessorament i suport de Frederick Rubino i Daniel Kahne.

Rubino i Kahne també els forniren de lípid II. Això els permeté d’estudiar la interacció directa de les malacidines amb precursors de la paret cel·lular, com el lípid II o el C55-P.

Els antibiòtics dependents de calci

Els antibiòtics dependents de calci són pèptids cíclic N-acilats. La seva acció antimicrobiana depèn de la unió a calci, que fan a través d’un motiu Asp-X-Asp-Gly de la seva seqüència peptídica. El més conegut és la daptomicina, que s’ha mostrat útil en el tractament de bacterèmies multiresistents. Aquests antibiòtics actuen interferint la biosíntesi de la paret cel·lular o afectant la integritat de la membrana cel·lular.

A partir del motiu Asp-X-Asp-Gly, com hem vist, Hover et al. aixequen el seu rastreig de sòls. Es tracta de trobar agrupacions de gens biosintètics que codifiquin aquestes seqüències.

Hom calcula que, en termes generals, cada gram de sòl conté un miler d’espècies bacterianes diferents. Així doncs, una col·lecció de 2000 sòls que sigui ecològicament i geogràficament diversa pot contindre un nombre d’espècies bacterianes superior a les de les col·leccions de cultius bacterians.

De les 2000 mostres de sòl, Hover et al. han trobat presència de dominis AD en tres quartes parts. D’aquests dominis AD tan sols un 13% es correspon a antibiòtics dependents de calci ja caracteritzats. I tan sols un 30% d’aquestes seqüències es troba en més d’una mostra. Aquestes xifres fan veure a Hover et al. que fins i tot una col·lecció de 2000 sòls dels Estats Units tan sols deu capturar una fracció de tota la diversitat biosintètica en antibiòtics dependents de calci. I això sense comptar que poden haver antibiòtics dependents de calci que utilitzin motius diferents a Asp-X-Asp-Gly.

La descoberta de les malacidines

El primer aspartat del motiu Asp-X-Asp-Gly és l’Asp4, i resulta el més rellevant des d’un punt de mira funcional. Una anàlisi filogenètica dels dominis AD recuperats per Hover et al. mostra una diversitat que depassa la dels antibiòtics dependents de calci prèviament coneguts. L’atenció la focalitzen en les seqüències més divergents que, alhora, siguin les més abundants. Una d’aquestes seqüències divergents és present al 19% dels metagenomes analitzats. A la família d’antibiòtics que s’hi correspon la denominen “malacidina”, a partir de l’acrònim de “metagenomic acidic lipopetide” + “cidina” (amb capacitat de matar).

La mostra de sòl DFD0097, corresponent a un sòl desèrtic, era ric en seqüències associades a aquestes malacidines. De la mostra de sòl elaboraren una llibreria de 20 milions de còsmids. La potència de la plataforma del grup de Brady es manifesta en la capacitat d’identificar en aquest oceà de còsmids, tres (DFD0097-644, DFD0097-735 i DFD0097-388) que contenen els 72 mil parells de nucleòtids d’un clúster de gens biosintètics. Generaren un cromosoma artificial bacterià (DFD0097-644:735:388) que feren créixer en cultius líquids de Streptomyces albus
J1074. Els extractes d’aquests cultius presentaven activitat antibacteriana contra Staphylococcus aureus. En aquests cultius aïllaren dos metabòlits específics, als que denominaren malacidina A i malacidina B.

La síntesi de malalcidines és codificada per un clúster de gens (mlcA, mlcK, mlcL, mlcM). Les malacidines són lipopèptids cíclics integrats per vuit aminoàcids i per lípids poliinsaturats.

La diferència entre la malacidina A i la malacidina B és la presència o absència d’un grup metilè en l’extrema de la cua lipídica. L’anell peptídic és de tan sols 10 aminoàcids. Les malacidines, de fet, no contenen el motiu Asp-X-Asp-Gly.

La dependència de calci de les malacidines

L’acció antibiòtica de les malacidines contra bacteris MRSA és clarament dependent de calci. En absència de calci, encara que hi siguin presents altres cations divalents les malacidines no tenen capacitat antibiòtica.

En presència de calci, però, les malacidines són actives contra un ventall de bacteris gram-positius, incloent-hi també patògens multiresistents.

La malacidina A reté la seva capacitat antibiòtica en presència de surfactants pulmonars. Això la diferencia de la daptomicina, que no és efectiva en pneumònies nosocomials perquè perd activitat en presència de surfactants.

L’administració de malacidina A per via tòpica és capaç de frenar la infecció amb MRSA en el model de ferida de rata.

Citotoxicitat i activitat hemolítica de les malacidines

En l’assajos de citotoxicitat i hemòlisi, les malacidines donen negatiu fins i tot en les concentracions més elevades (100-250 µg/mL).

Resistència a les malacidines

Malgrat els assajos realitzats, Hover et al. no han aconseguit la detecció de resistències a malacidines. Per exemple, després de 20 dies d’exposició a concentracions subletals de malacidina A, no detectaren la presència de S. aureus que en foren resistents a concentracions letals. Una línia de recerca que s’obre és la detecció de bacteris ambientals que siguin resistents a malacidina, i la possibilitat de transferència horitzontals dels gens de resistència corresponents.

El mecanisme d’acció de les malacidines

Les malalcidines no semblen actuar en la integritat de membrana, com si ho fa la daptomicina (a través de l’oligomerització de fosfolípids).

En presència de calci, però, les malacidines interfereixen en la síntesi de paret bacteriana. La malacidina interactua amb el lípid II, precursor necessari per a la paret cel·lular. Aquest és el mecanisme d’acció de la vancomicina, un antibiòtic clínic de darrer recurs. És molt interessant que la malacidina sigui activa, però, contra patògens resistents a la vancomicina.

El potencial dels mètodes metagenòmics de descoberta d’antibiòtics

Hover et al. tenen la intenció d’escalar i automatitzar la plataforma eSNaPD 2.0. Aquesta plataforma permetria la descoberta sistemàtica de productes naturals amb propietats antibiòtiques. La perspectiva metagenòmica fa que les malacidines hagin estat descobertes sense haver ni cultivat ni identificat el microorganisme que les sintetitza. El punt de partida, això sí, era el coneixement sobre antibiòtics dependents de calci.

Com diuen Hover et al, “els microbis ambientals són en una cursa armamentística continua”. Si per cada antibiòtic han d’aparèixer selectivament mecanismes de resistència, també per cada mecanisme de resistència es desenvolupen nous antibiòtics. Aquesta cursa armamentísica,
quan parlem de microorganismes patògens, i més en l’entorn de les infeccions nosocomials, es dispara a una escala descomunal. I caldrà veure encara si la descoberta i introducció de nous antibiòtics efectius es farà en les properes dècades a un ritme suficient.

Lligams:

Culture-independent discovery of the malacidins as calcium-dependent antibiotics with activity against multidrug-resistant Gram-positive pathogens. Bradley M. Hover, Seong-Hwam Kim, Micah Katz, Zachary Charlop-Powers, Jeremy G. Owen, Melinda A. Ternei, Jeffrey Maniko, Andreia B. Estrela, Henrik Molina, Steven Park, David S. Perlin, Sean F. Brady. Nature Microbiology doi:10.1038/s41564-018-0110-1 (2018).

Environmental Surveyor of Natural Product Diversity.

Aquesta entrada ha esta publicada en 3. La Vida. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.