L’autoreplicació dels pipolins: una ADN polimerasa B que no requereix encebador

Les polimerases d’ADN són enzims que catalitzen la incorporació de mononucleòtids a cadenes d’àcid desoxirribonucleic. Participen, doncs,
en la replicació de l’ADN, però també en processos de reparació i de recombinació. Se n’han descrit diverses famílies d’aquests enzims: A,
B, C, D, X, Y, RT. La família B de polimerases inclou les que s’encarregueren de la replicació dels genomes d’arqueons i d’eucariotes, tot i que participen també en processos de reparació d’aquests organismes i de bacteris. En les funcions replicatives les ADN polimerases B requereixen un encebador d’ARN o d’ADN, a partir del qual poder iniciar reaccions d’elongació d’una cadena d’ADN. Aquest encebador extern en alguns casos pot ser substituït per una proteïna terminal. No obstant, un grup d’investigadors encapçalat per Modesto Redrejo-Rodríguez, del Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” del CSIC, descriuen un tercer cas d’ADN polimerases B en les quals no és necessari encebador. Tal com expliquen en un article a Cell Reports, la síntesi d’ADN independent d’encebador és catalitzada per una ADN-polimerasa de la família B en l’autoreplicació d’un grup d’elements genètics mòbils conegut com a pipolins.

Electroforesi en gels d’agarosa que mostra la capacitat de síntesi d’ADN per l’enzim piPolB en abspència d’encebador

La família B d’ADN polimerases

Aquesta recerca fou concebuda per Modesto Redrejo-Rodríguez, del Centro Severo Ochoa del CSIC. En la investigació participaren altres membres d’aquest centre: Carlos D. Ordóñez, Mónica Berjón-Otero (ara en el Max Planck de Heidelberg), Juan Moreno-González i Cristian Aparicio-Maldonado (ara en la Universitat Tecnològica de Delft). També participà Mart Krupovic, de l’Institut Pasteur. Redrejo-Rodríguez i els seus companys són membres del laboratori de Margarita Salas, que participà en la redacció de l’article juntament amb Redrejo-Rodríguez i Krupovic. El text original fou enviat el 10 de març del 2017. Donada la dimensió de les afirmacions, seguí un procés de resposta als reviros, en el qual participà també Patrick Forterre, de l’Institut Pasteur. En la forma revisada fou lliurat a Cell Reports el 19 de setembre, que l’acceptà l’11 d’octubre, publicant-lo avui 7 de novembre.

Fins ara la família B d’ADN polimerases era distribuïda en dos grans grups:
– les que utilitzen com a encebador ARN (substituïble en alguns casos per ADN), les rPolB.
– les que utilitzen com a encebador una proteïna terminal, les pPolB.

Aquests dos grups no sols tenen una base funcional sinó també filogenètica. Les rPolB són bàsicament replicases, és a dir enzims que catalitzen la còpia acurada i eficient de genomes cel·lulars i virals. Les pPolB són exclusives d’elements genètics mòbils i de virus de genomes lineals inferiors a 50 kb, com el Φ29.

Les pPolB presenten dos subdominis característics:
– TRP1 és el domini d’interacció amb la proteïna terminal (proteïna encebadora).
– TRP2 és el domini que permet a la polimerasa la processivitat i la capacitat de desplaçament.

Les aplicacions biotecnològiques de la pPolB del bacteriòfag Φ29 han estimulat la recerca de pPolB. Hom ha vist que diversos elements genètics mòbils en fan ús, com és el cas dels Polintons o Mavericks, o el dels casposons, als qui confereixen capacitat autosintètica o autoreplicativa.

Redrejo-Rodríguez et al., cercant altres exemples de pPolB han topat amb una superfamília fins ara desconeguda d’elements genètics mòbils, als que denominen “pipolins”. Els pipolins són presents en un ventall de bacteris i en mitocondris (al capdavall, el genoma mitocondrial és una forma derivada d’un genoma bacterià). Redrejo-Rodríguez et al. han fet la caracterització bioquímica del pPolB d’un pipolí d’Escherichia coli. En trobar que aquest enzim és capaç de fer síntesi d’ADN de novo, sense encebador, proposen classificar-lo en una tercera categoria dins de la família B: les piPolB. És d’aquesta denominació que han extret el nom de “pipolí”.

Una recerca de pPolB en les bases de dades genètiques

Redrejo-Rodríguez et al. partiren d’una recerca sobre els genomes bacterians coneguts emprant la seqüència d l’enzim pPolB del bacteriòfag Bam35. Centraren l’atenció en seqüències que mantenien els dominis TRP1 i TRP2, però que tan sols mantinguessin una identitat de seqüència del 16-20% amb Bam35-pPolB. En trobaren en plàsmids i en bacteris de diversos grups (firmicutes, actinobacteris i proteobacteris).

La replicasa de E. coli 3-373-03-S1_C2

Redrejo-Rodriguez et al. clonaren el gen corresponent a la piPolB d’un pipolí d’Escherichia coli. N’estudiaren les activitats sintètica i degradativa. En absència de dNTPs, l’activitat enzimàtica és d’exonucleolísi, però quan s’afegeixen aquests substrats, l’enzim passa a polimeritzar. L’activitat replicasa és eficient i fidel.

Fou en assaigs sobre encebament, que Redrejo-Rodríguez et al. detectaren que la piPolB era capaç d’ADN síntesi sense encebador proteic o nucleic. És cert que en altres famílies d’ADN polimerases trobem enzims que no requereixen encebadors, les anomenades primases, que són les que generen els encebadors per a les replicases eficients. No obstant, piPolB es diferencia de les primases canòniques en el fet que és capaç d’iniciar la síntesi d’ADN amb independència de la seqüència de la cadena motllo: les primases canòniques comencen sempre en seqüències “origen” específiques.

Un rol beneficiós de piPolB en Escherichia coli

Redrejo-Rodríguez et al. estudien cultius d’E. coli Bl21(DE3) que contenen pipolí i expressen l’enzim piPolB. L’expressió d’aquest enzim protegeix els bacteris d’agents genotòxics com la mitomicina C i la radiació ultraviolada. Suposen que l’activitat primasa de l’enzim piPolB contribueix als mecanismes de reparació d’ADN.

Pipolins i piPolB

La comparació filogenètica entre ADN-polimerases de la família B, indica que les piPolB suposen una tercera agrupació a banda de pPolB i de rPolB. La filogènia de les piPolB segueix en bona mesura la filogènia dels bacteris que hostatgen els respectius pipolins, cosa que indicaria una coevolució entre pipolins i bacteris hostes.

Si bé una part important dels pipolins es troben integrats en el genoma bacterià, d’altres es troben en forma de plàsmids. També hi ha pipolins en plàsmids de mitocondris. Com que els primers mitocondris devien aparèixer fa uns 2000 milions d’anys, cal pensar que els pipolins són encara més antics.

Les aplicacions biotecnològiques de piPolB

Redrejo-Rodríguez et al. pensen en la possibilitat d’emprar piPolB en processos d’amplificació genòmica independents d’encebador. Activitats de la piPolB com el desplaçament de cadena (exonucleasa) i la polimerització fidel i processiva en serien l’ingredient. L’enzim piPolB podria utilitzar-se com a enzim únic en formulacions d’amplificació genòmica a partir d’una sola còpia (d’una sola cel·lula).



Aquesta entrada ha esta publicada en 3. La Vida. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *