La inactivació de l’ARN llarg no-codificant TP53TG1 en tumors humans

El dogma central de la biologia molecular assenyalava que el flux d’informació genètica anava de l’ADN a la proteïna, a través de l’ARN, en el benentès que un gen dóna lloc a una proteïna. Naturalment, la qüestió és molt més complexa. En el nucli cel·lular es transcriuen gens donant lloc a molècules d’ARN llargues que no seran traduïdes després en proteïnes. Aquests ARN llargs no-codificants (ARNlnc) poden tenir funcions reguladores rellevants. Un exemple el forneix un estudi coordinat per Manel Esteller, que ha estat publicat a la revista PNAS. L’article reporta un d’aquests ARNlnc, TP53TG1, que participa en el control cel·lular que exerceix la proteïna supressora de tumors p53 en resposta a la detecció de dany genòmic. Concretament, TP53TG1 bloca l’activitat de la proteïna d’unió a ARN, YBX1. Diaz-Lagares et al. han trobat en tumors de colon i d’estòmac particularment agressius, resistents a la quimioteràpia, que el gen TP53TG1 es troba silenciat mitjançant metilació d’ADN. De fet, aquest silenciament gènic provoca que la proteïna p53 no pugui actuar blocant bona part dels efectes antitumorals que hauria de tindre la quimioteràpia. Els autors de l’estudi considera la troballa rellevant per dissenyar eines diagnòstiques en el càncer.

Una recerca dissenyada per Angel Diaz-Lagares, Sonia Guil i Manel Esteller

La recera fou dissenyada en el marc del Programa d’Epigenètica i Biologia del Càncer (PEBC) de l’Institut de Recerca Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL), per Angel Diaz-Lagares, Sonia Guil i Manel Esteller. En la realització dels experiments participaren, a més de Diaz-Lagares i Guil, Ana B. Crujeiras, Paula Lopez-Serra, Marta Soler, Fernando Setien, Ashis Goyal (del DKFZ de Heidelberg), Yutaka Hashimoto, Anna Martinez-Cardús, Antonio Gomez, Holger Heyn, Catia Moutinho, Jesús Espada (de l’Institut Ramón y Cajal de Recera Biomèdica de Madrid), August Vidal (del Departament de Patologia de l’Hospital de Bellvitge), Maria Paúles (del Departament de Patologia), Maica Galán (del Departament d’Oncologia Mèdica de l’ICO), Núria Sala (de la Unitat de Nutrició i Càncer de l’ICO), Yoshimitsu Akiyama (de la Universitat Mèdica i Dentral de Tòkio), María Martínez-Iniesta (del Programa Contra la Resistència Terapèutica del Càncer, ProCURE, de l’ICO), Lourdes Farré (de ProCURE), Alberto Villanueva (de ProCURE), Matthias Gross (del DKFZ) i Sven Diederichs (del DKFZ). En l’anàlisi de dades participaren també Juan Sandoval (del PEBC). La redacció de l’article l’emprengueren Diaz-Lagares, Guil i Esteller, que el trameteren a la revista PNAS el passat 27 de maig.

El transcriptoma no-codificant

De tot el genoma humà, tan sols un 2% es correspon a seqüències transcrites a ARNmissatger (ARNm) i traduïdes a proteïna. De fet, la major part del genoma transcrit, és a dir del transcriptoma, és no-codificant, és a dir que no és traduït a proteïna. Dels diferents ARN no-codificants:
– n’hi ha de curts, com els ARNmi, que tenen longituds de 19-25 nucleòtids, i tenen un important paper en la regulació de l’expressió de gens, sobretot a través de la interacció directa amb ARNm.
– els llargs (ARNlnc), amb seqüències de més de 200 nucleòtids. Tenen algunes característiques compartides amb els ARNm: estructura d’exons-introns, cua poliA, etc. De fet, una part dels ARNlnc són transferits al citoplasma. La part que roman en el nucli pot participar en la regulació de la condensació de la cromatina, l’splicing d’ARNm i la transcripció d’altres gens. En els darrers anys hom ha descrit oncogens i gens supressors de tumors que expressen ARNlnc. La desregulació d’aquests gens no-codificants en tumors no es deu únicament a mutacions genètiques sinó també a alteracions epigenètiques.

Canvis de metilació en l’ADN que afecten gens de ARNlnc en la línia cel·lular tumoral HCT-116

En el 1982, a partir d’una biòpsia d’un pacient amb carcinoma de còlon, es van establir tres línies cel·lulars tumorals, una de les quals va rebre la designació de HCT-116. En el 2002, en una sublínia de cèl·lules HCT-116 (DKO) s’identificà l’anul·lació, per recombinació homòloga, dels gens DNMT1 i DNMT3b, que codifiquen per a ADN-metilases, enzims que catalitzen la metilació específica de l’ADN. Aquestes cel·lules DKO tenen una activitat ADN-metilasa reduïda, uns valors inferiors de 5-metilcitosina en el seu ADN i un perfil de transcripció lligat a la hipometilació d’illes CpG.

Diaz-Lagares et al. obtingueren perfils de metilació d’ADN per a cèl·lules HCT-116 originals, per a les cèl·lules DKO i per a mucosa normal humana. Aquest perfil de metilació cobreix un total de 482.422 illes CpG. Dels gens d’ARNlnc n’hi ha 104 que tenen illes CpG en les regions promotores/reguladores 5′.

El fet de combinar un patró de mucosa colònica normal amb les cèl·lules HCT-116 i les cèl·lules DKO pot evidenciar les illes CpG amb nivells elevats de metilació associats a la transformació tumoral. Posant un nivell de tall de 70% en nivell de metilació en cèl·lules HCT-116 respecte les cèl·lules DKO, dels 104 gens d’ARNlnc analitzats n’hi ha deu que resulten positius: TP53TG1, NCRNA00028, LOC157627, MIR155HG, WT1AS, C20orf200 i MYCNOS. D’aquests deu gens, el valor més destacable d’hipermetilació tumoral és el TP53TG1.

El silenciament de TP53TG1 en diverses línies cel·lulars tumorals

Diaz-Lagares et al. han estudiat l’inici de transcripció del gen TP53TG1 en cèl·lules tumorals. La seqüenciació genòmica per bisulfit confirma que en cèl·lules HCT-116 l’illa CpG associada a l’inici de transcripció del gen TP53TG1 es troba fortament metilada en comparació amb la mucosa colorectal normal.

També estudiaren la metilació del promotor del gen TP53TG1 en unes altres 12 línies cel·lulars tumorals gastrointestinals. La hipermetilació tan sols la trobaren en 3 d’aquestes 12 línies: la línia colorectal KM12 i les línies de càncer d’estòmic KATO-III i TGBC11TKB.

Les línies tumorals que mostren una hipermetilació en el gen TP53TG1 perden l’expressió d’aquest gen. Si hom administra a les cèl·lules un agent demetilador, la 5-aza-2′-desoxicitidina, l’expressió del gen TP53TG1 torna a valors normals.

En cèl·lules DKO, Diaz-Lagares et al. han comprovat també que el transcrit del TP53TG1 s’expressa en el nucli i en el citoplasma, però que en cap cas no arriba a traduir-se en proteïna.

La capacitat supressora de tumors de TP53TG1

La transfecció d’un plàsmid amb el gen TP53TG1 a cèl·lules HCT-116 en redueix la capacitat proliferativa. Això s’associa amb una inducció de l’apoptosi. També es redueix la capacitat invasiva i migrativa. Diaz-Lagares estudien aquests efectes tant en assaigs in vitro com en assaigs in vivo en ratolins.

El rol de TP53TG1 en l’acció antitumoral de fàrmacs citotòxics a través de la p53

L’ARN TP53TG1 és un dels transcrits estimulats per la proteïna antitumoral p53. La proteïna p53 és un dels connectors més importants en la cèl·lula en la detecció de dany genètic greu que, en condicions normals, mena la cèl·lula a l’apoptosi. Diaz-Lagares et al. han vist com en diferents línies cel·lulars tumorals, agents citotòxics indueixen no tan sols la p53 sinó també la TP53TG1. La inducció de TP53TG1 sembla mediada per la p53, ja que no es presenta en la línia tumoral colo-rectal SW-620, que és defectiva per a la p53.

L’assaig d’immunoprecipitació de cromatina mostra que la p53 s’uneix a una seqüència de l’intró 2 del gen TP53TG1.

Resultats de diversos experiments que mostren la interacció entre la proteïna p53 i el gen TP53TG1. Diverses línies tumorals (SW-620, SW-48, SNU-1 foren exposades a diferents agents citotòxics (bleomicina, cisplatí, etopòsid).

Segons mostren les dades en cèl·lules HCT-116 transfectades amb el gen TP53TG1, bona part dels efectes antitumorals mediats per la p53 cursen a través de l’acció de TP53TG1.

La interacció de l’ARNlnc TP53TG1 amb proteïnes

Exposant un ARNlnc TP53TG1 sintetitzat in vitro amb extractes de cèl·lules epitelials colòniques humanes (HCEC), Diaz-Lagares et al. identificaren una proteïna de 45 kD que s’hi uneix de manera específica. La caracterització per espectrometria de masses mostrà que aquesta proteïna és la YBX1. La YBX1 és una proteïna d’unió a àcids nucleics, implicada en nombrosos processos en condicions fisiològiques, però també en processos tumorals (progressió, metàstasi, resistència a fàrmacs).

Mitjançant una sèrie de mutacions per deleció, Diaz-Lagares et al. identifiquen que la regió de TP53TG1 d’unió a YBX1 es troba en el centre del transcrit. Aquesta regió conté cinc motius CACC, amb afinitat amb la proteïna YBX1.

L’efecte de TP53TG1 sobre la proteïna YBX1

La transfecció de TP53TG1 en cèl·lules HCT-116 no afecta la YBX1 ni en els nivells d’ARNm ni en els de proteïna. El silenciament del gen TP53TG1 en cèl·lules HCEC tampoc no afecta aquests nivells.

No obstant, quan Diaz-Lagares et al. analitzen els nivels de proteïna YBX1 de manera compartimentalitzada es troben amb el fet que la funcionalitat de TP53TG1 provoca l’exclusió de la proteïna YBX1 del nucli cel·lular.

L’acció de l’ARN TP53TG1 sobre la proteïna YBX1 es manifesta en la localització cel·lular: YBX1 veu barrada la seva entrada al nucli cel·lular si TP53TG1 és expressat amb prou força.

Si la proteïna YBX1 no arriba al nucli cel·lular no pot produir els seus efectes gènics. Entre aquests efectes hi ha la promoció de la transcripció del gen PI3K. La via de la PI3K té un caràcter proliferatiu, amb l’estimulació de la fosforilació d’AKT i MDM2, i antiapopòtic, amb la degradació de p53.

Epidemiologia molecular: la hipermetilació de TP53TG1 en tumors gastrointestinals

Diaz-Lagares et al. completen el seu estudi examinant dades genòmiques i epigenòmiques de col·leccions de tumors humans primaris gàstrics i colorectals. La prevalença d’hipermetilació TP53TG1 és de 4-6% en tumors colorectats i de 10-13% en tumors gàstrics.

Diaz-Lagares et al. han centrat elseu interès en tumors primaris d’estòmac, on la prevalença de la hipermetilació de TP53TG1 és més elevada. En neoplàsies primàries d’estòmac troben efectivament una correlació entre la metilació d’aquest gen i el seu silenciament. En 63 tumors primaris dels quals tenien informació detallada, van veure com la hipermetilació de TP53TG1 s’associava amb una menor supervivència. Les dades d’immunohistoquímica mostraven que els pitjors resultats clínics s’associaven a la presència d’YBX1 en el nucli

Una ruta antitumoral de bloqueig de l’entrada d’YBX1 al nucli cel·lular

L’estudi és un bon exemple de com un canvi epigenètic pot afavorir processos tumorals. A més, aquest canvi epigenètic no es produeix en un gen de proteïnes sinó en un gen corresponent un ARN no-codificant. Aquest ARN no-codificant bloquejaria, en ser activat per la p53, la translocació cap al nucli de la proteïna YBX1. El balanç entre la ruta proliferativa YBX-1/PI3K i la ruta pro-apotòtica p53 és només un dels múltiples balanços de la xarxa d’interaccions moleculars present en les cèl·lules epitelials gastrointestinals. Però en quedar blocada la via p53-TP53TG1, les cèl·lules tumorals es fan més resistents a la quimioteràpia, ja que no responen amb apoptosi al dany genètic massiu que indueixen aquests fàrmacs.

És per això darrer que Diaz-Lagares et al. consideren que “la detecció de la hipermetilació de TP53TG1 podria esdevindre un marcador valuós en la teràpia antitumoral personalitzada”. Per això, és clar, seran necessaris assaigs clínics.



Aquesta entrada ha esta publicada en 3. La Vida. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *