Proteïna fluorescent verda reporta (Shimomura, Chalfie, Tsien – Nobel de Química, 2008)

En la pràctica diària de la biologia molecular les tècniques de visualització són essencials. Cal fer que l’objecte d’experimentació (en darrer terme, molècules de proteïna, àcid nucleic, glúcid, lípid, etc.) es faci visible als ulls de l’experimentador, de l’investigador, etc., i del revisor i del lector de l’article. Moltes tècniques de visualització es fonamenten en la fluorescència, és a dir en la capacitat de certes substàncies d’emetre llum quan són il·luminades. La biofluorescència existeix destacadament en alguns organismes marins. Un exemple de proteïna fluorescent és la proteïna fluorescent verda (GFP) de meduses com Aequorea victoria. Aquesta proteïna fou descoberta el 1962 per Osamu Shimomura. Més tard, investigadors com Martin Chalfie i Roger Y. Tsien iniciaren una línia de recerca per trobar aplicacions de la GFP en la biologia molecular. Així és com construccions fetes a partir del gen de la GFP han servit per analitzar l’expressió gènica en un ampli ventall d’organismes: ja que, gràcies a les fluorescència, hom pot veure una proteïna que, altrament, com la majoria, seria indistingible a primera vista.

Una medusa del gènere Aequorea. La luminiscència dels tentacles (on s’allotgen els temibles cnidoblasts) es deu a una barreja de substàncies. Una d’elles és l’aequorina o GFP, una proteïna que, en determinades circumstàncies, emet una llum verdosa sota il·luminació blava

Osamu Shimomura

Osamu Shomomura (*Kyoto, 1928) es va doctorar en química orgànica a la Universitat de Nagoya (1960). Gairebé tota la seva carrera post-doctoral l’ha fet als Estats Units i, en l’actualitat, és professor emèrit del Marine Biological Laboratory de Woods Hole (Massachussetts) i de la Boston University Medical School.

Martin Chalfie

Martin Chalfie (*1947), crescut a Chicago, es va doctorar en neurobiologia el 1977 a la Universitat de Harvard. Des de 1982 és professor de ciències biològiques a la Columbia University (NY).

Chalfie ha estat sempre especialment interessat en sis cèl·lules del cuc nemàtode Caenorhabditis elegans: les sis neurones que participen en percepcions tàctils. En aquest model, Chalfie es demana:

– com es determina el destí neuronal, és a dir que una neurona esdevingui part de tal o tal sistema sensorial o de tal o tal sistema motor, etc.

– quina és la base molecular de la mecanocepció, és a dir quines proteïnes aconsegueixen de transformar un estímul mecànic extern a la neurona en una alteració electroquímica de la membrana cèl·lular (la base de l’impuls nerviós).

Roger Y. Tsien

Roger Y. Tsien (*NY, 1952) es va doctorar en fisiologia a la Universitat de Cambridge (UK) el 1977. Des de 1989 és professor de la Universitat de Califòrnia a La Jolla, on regenta el Tsien Laboratory. És un dels grans noms en l’aplicació de l’enginyeria genètica per al disseny de nous marcadors i proteïnes fluorescents, i per l’aplicació en el seguiment de processos biològics (Lin et al., 2008). Des de fa uns anys el seu laboratori treballa “en el desenvolupament d’una nova forma de visualitzar i fins i tot vehicular específicament fàrmacs en el tractament de tumors”.

La descoberta de la GFP

La biofluorescència (i altres fenòmens de bioluminiscència) d’algunes espècies de meduses eren ja conegudes d’antuvi. La qüestió per al bioquímic, però, era identificar la substància o substàncies fluorescents que expliquessin aquesta propietat. Cal esperar, però, a la segona meitat del segle XX per poder practicar purificacions a partir d’una quantitat raonable (que ara ens sembla descomunal) de material biològic. És clar que la purificació d’una proteïna fluorescent, si més no, no requeria de complexes tècniques de detecció (enzimàtiques, immunològiques, etc.) sinó que n’hi havia prou amb seguir la fracció de l’extracte més fluorescent. Fou així com, entre 1960 i 1962, Osamu Shimomura aconseguí d’aïllar i cristal·litzar una proteïna que, sota una làmpada d’ultraviolat, emetia una llum verda. Encara que Shimomura la va batejar (Shimomura et al. 1962) amb el nom de aequorina (en honor de les meduses de l’espècie Aequora victoria que havia hagut de trinxar), molt assenyadament la posteritat l’ha coneguda com a Proteïna Fluorescent Verda (Green Fluorescent Protein, GFP).

La GFP com a marcador fluorescent

Una de les aplicacions pràctiques de la biologia marina, especialment a partir dels anys 1960, ha estat la recerca de fluorocroms, és a dir de substàncies bioquímiques fluorescents. Aquests fluorocroms poden ésser lligats a proteïnes (p. ex. anticossos), que queden així visualitzables: en col·locar una preparació marcada amb fluorocroms sota un raig ultraviolat incident hom pot veure emissions de diferent coloració. Alguns fluorocroms, per ells mateixos, també tenen interès quan emeten llum únicament sota un determinat estímul (i així hi ha tot un ventall de fluorocroms que es poden utilitzar per detectar biomolècules de molt baixa concentració).

Però, ja en els anys 1970, Martin Chalfie sabia que la GFP era quelcom més que un fluorocrom. En aquest cas, el fluorocrom anava ja adosat a una proteïna. Si hom aconseguia clonar el gen de la GFP podria fer-lo servir d’eina de marcatge genètic. Per exemple, hom podria construir un gen hemisintètic amb la part codificant del gen de la GFP però sota el promotor d’un gen problema. Si aquest gen fos introduït en un organisme, hom podria visualitzar la GFP i, a grans trets, la distribució de la GFP en aquest organisme es correspondria a la distribució de la proteïna problema. Martin Chalfie dugué a la pràctica aquesta idea. El seu organisme de treball era el cuc nemàtode Caenorhabditis elegans, del qual investigava els processos fonamentals de formació del sistema nerviós. Gràcies a l’enginyeria genètica, llavors a les beceroles, va poder estudiar diversos gens de C. elegans i veure en quines part del cos (fins i tot en quines cèl·lules) s’expressaven gràcies a la introducció del gen de la GFP sota el promotor de cadascun d’aquests gens.

Els derivats de la GFP: més enllà del verd

Roger Y. Tsien emprà les tècniques d’enginyeria genètica per modificar la part codificant del gen de la GFP. Fou així que, a partir dels anys 1990, ha obtingut un ventall de proteïnes fluorescents que emetien fluorescències de diversos colors. D’aquesta manera experiments individuals com els de Chalfie (un per cada gen problema) es podrien replicar en un sol experiment. Alhora, les modificacions permetien una major diversitat de comportaments de les proteïnes fluorescents i aplicacions encara molt més ambicioses que no pas havia imaginat Chalfie.

Avui dia ja no cal matxucar meduses i d’altres criatures marines per arreplegar uns tristos micrograms de fluorescència. Les proteïnes fluorescents es fabriquen en bacteris en els quals s’hi ha introduït els gens corresponents. En la imatge tenim una placa on s’han sembrat bacteris recombinants que fabriquen diferents variants de la GFP

Aquesta entrada ha esta publicada en General. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

Aquest lloc utilitza Akismet per reduir el correu brossa. Aprendre com la informació del vostre comentari és processada