Modificacions específiques de gen (Capecchi, Evans i Smithies; Premi Nobel de Fisiologia-2007)

Genètica: Les primeres tècniques de transgènesi es basaren en la introducció de material genètic forani en un genoma (de bacteri, de planta, d'animal, etc.). La introducció, en aquest cas, es feia (i es fa) "a cegues". Hom suposa que el material genètic forani s'inserirà en un lloc més o menys adient. Si l'organisme transgènic així generat presenta la propietat nova que esperàvem, hom accepta el transgènic per bo. Mario R. Capecchi, Martin J. Evans, Oliver Smithies i d'altres obriren una nova via en la transgènesi en desenvolupar en el ratolí tècniques de modificació específiques de gens. Amb aquestes tècniques hom pot suprimir un gen en concret ("knock out"), o bé el pot substituir per un altre ("knock in") o, si li plau, pot fer que canvii el seu patró d'expressió ("knock off"). Aquestes tècniques s'han aplicat sobretot a la genòmica funcional (l'estudi del paper funcional individual dels gens) i a la recerca bàsica en general. Però de mica en mica també s'obren pas en l'obtenció de nous organismes modificats genèticament amb finalitats pràctiques. Avui s'ha sabut que Capecchi, Evans i Smithies rebran, a parts iguals, el Premi Nobel de Fisiologia o Medicina de l'any 2007.[@more@]

Mario R. Capecchi

Mario R. Capecchi (*Verona, 6.10.1937) va graduar-se en química i física a l'Antioch College (Ohio) el 1961. Es doctorà en biofísica a la Harvard University el 1967, sota la direcció de James D. Watson (*1928). La seva estada a Harvard es perllongà el 1973, quan passà a la University of Utah on ha desenvolupat la seva tasca investigadora i docent a través del "Capecchi lab". Des del 1988 el treball a Utah l'ha combinat amb la recerca al Howard Hughes Medical Institute (HHMI).

La recerca de Capecchi s'orienta cap a la genètica molecular del desenvolupament dels mamífers, és a dir a quin paper en concret juga tal o tal gen en tal o tal fase del desenvolupament embrionari. Ha publicat especialment en el camp de la genètica de la neurogènesi (formació del teixit nerviós i de les seves estructures), l'organogènesi (formació d'òrgans a partir de la imbricació de diferents teixits), la formació de la columna vertebral i de els extremitats, etc. Algunes de les soques de ratolins "knock out" generats per Capecchi i els seus col·laboradors també s'han emprat com a models de malalties tumorals i neuropsicològiques.

Martin J. Evans

Martin J. Evans (*Stroud, Gloucestershire, 1.1.1941) va graduar-se a Cambridge el 1963. Des d'un bon principi l'interessà l'estudi del control genètic del desenvolupament de vertebrats, i amb aquest pensament començà la tesi a l'University College de Londres. Mitjançant tècniques de separació electroforètica en gel d'agarosa i tècniques de marcatge radiactiu, Evans estudià els canvis en el perfil de l'ARN missatger durant la inducció neural de la rana Xenopus laevis. Però aplicar aquestes noves tècniques als models clàssics com el dels embrions de X. laevis era força ingrat. Això menà Evans a emprar com a model cultius cel·lulars procedents de teratocarcinomes de ratolí. Fou el primer en reeixir en el cultiu d'aquestes cèl·lules totipotencials (o cèl·lular mare). Amb la introducció d'aquestes cèl·lules totipotencials a embrions normals de ratolí obria una porta a l'obtenció d'adults "quimèrics".

El 1981, Evans i Matt Kaufman aconseguiren d'aïllar cèl·lules totipotencials d'un comportament similar a partir d'embrions normals. Aquestes cèl·lules, investigades al llarg dels projectes de recerca de Liz Robertson i Allan Bradley, rebrien finalment el nom de "cèl·lules mare embrionàries" ("embryonic stem cells"). Fou en aquestes cèl·lules mare embrionàries que fou possible l'obtenció dels primers ratolins "knock out" per a gens concrets.

Assolida la tècnica de "knock out" i les tècniques de "captura de gens" ("gene trap"), el grup d'Evans s'ha dedicat al desenvolupament de models animals de malalties humanes. Així hom ha treballat sobre el gen CFTC (el gen que es troba mutat en la fibrosi cística) i el gen BRCA2 (mutacions del qual són responsables d'alguns casos familiars de càncer de mama). El grup d'Evans també ha estat pioner en les tècniques de microarray, amb les quals hom pot resseguir simultàniament l'expressió de múltiples gens en una mateixa mostra biològica: què no hauria fet el jove Evans 45 anys abans si hagués disposat d'aquestes tècniques transcriptòmiques?

Oliver Smithies

Oliver Smithies (*Halifax, West Yorkshire, 23.7.1925) es va graduar en Fisiologia al Balliol College d'Oxford. Allà mateix va obtindre un mestratge en fisiologia (1951) i s'hi va doctorar en bioquímica (1951). Per treure endavant aquestes titulacions, Smithies fou un dels pioners de les tècniques d'electroforesi en gels. Aquestes tècniques consisteixen en la confecció de gels (d'agarosa, poliacrilamida, etc.), en un extrem dels quals hom hi col·loca, degudament processada, la mostra a analitzar. Seguidament hom col·loca el gel sota un camp elèctric: d'acord amb el pes molecular i la càrrega elèctrica, les diferents molècules de la mostra adoptaran una mobilitat diferenciada.

Anys més tard, ja als Estats Units, Oliver Smithies també seria un dels pioners en l'ús del fenomen de la recombinació homòloga per aconseguir una manipulació genètica dirigida i específica. La recombinació homòloga consisteix en el bescanvi d'informació de dues molècules d'ADN que comparteixen una seqüència més o menys idèntica. Si hom aconsegueix de recombinar una molècula d'ADN semi-artificial amb el genoma de cèl·lules mare embrionàries de ratolí pot aconseguir de blocar-hi ("knock out") un gen concret.

Modificacions específiques de gen a través de cèl·lules mare embrionàries de ratolí

L'Acadèmia de Ciències sueca ha triat aquests tres investigadors per premiar "les descobertes dels principis per la introducció de modificacions específiques de gens en ratolí mitjançant l'ús de cèl·lules mare embrionàries".

El jurat ha valorat la contribució fonamental d'Evans en la identificació i aïllament de cèl·lules mare embrionàries a partir d'embrions primerencs. Com hem dit va aconseguir de cultivar aquestes cèl·lules i de generar a partir d'elles embrions quimèrics que podien ser implantats en l'úter de ratolins. Les tècniques clàssiques de manipulació genètica (introducció aleatòria de material genètic) s'hi veien clarament afavorides, ja que la monitorització i selecció es podia fer a nivell de cultiu cel·lular i no d'embrió.

En el cas dels embrions de ratolí, en l'estadi de blàstula, hom pot aïllar cèl·lules totipotencials. Aquestes cèl·lules es poden mantenir indefinidament com a cultius cel·lulars i se les pot modificar genèticament. Les cèl·lules modificades es poden injectar a embrions normals. D'aquests embrions surten exemplars adults quimèrics. Mitjançant creuament hom pot arribar a aconseguir ratolins que presenten en tot l'organisme la modificació genètica induïda en el cultiu cel·lular.

Els grups de Capecchi i Smithies posaren la base per l'aplicació de la recombinació homòloga en les tècniques de modificació genètica. Amb aquestes tècniques hom podia dirigir la modificació a un gen concret per tal d'eliminar (noquejar-lo, i d'ací l'expressió "knock-out").

La recombinació homòloga havia estat descoberta originàriament en bacteris per Joshua Lederberg a mitjans del segle XX. En els anys 1970 hom mostrà que la recombinació homòloga és el mecanisme que subjau en la recombinació intracromosòmica que s'hi dóna en la formació de gàmetes (òvuls i espermatozoides). Gràcies a aquestes recombinació intracromosòmica, cadascun dels nostres cromosomes recull material genètic dels cromosomes patern i matern de cadascun dels nostres progenitors: sense ells, tots els cromosomes passarien de generació en generació intactes, tal com és el cas del cromosoma Y.

Dues estratègies per la modificació del material genètic d'una cel·lula. A la dreta tenim el procediment clàssic, basat en la inserció aleatòria del transgen. A l'esquerra es produeix una recombinació homòloga entre el transgen i el genoma cel·lular, com a conseqüència de la qual una part del trangen pot ésser-hi incorporada. Aquesta darrera tècnica és l'emprada en la "mutagènesi dirigida" que dóna lloc a ratolins "knock out" per un gen.

Richard Axel va mostrar que hom podia restaurar l'activitat timidina-cinasa de cultius cel·lulars que l'havien perdut genèticament si se'ls exposava al gen de timidina-cinasa herpesviral. Capecchi millorà el procés d'exposició a ADN forani mitjançant microinjeccions directes en el nucli cel·lular. Capecchi també mostra que el gen de la timidina-cinasa herpesviral tan sols s'introduïa en dos localitzacions concretes del genoma. El patró d'inserció mostrava sovint diverses repeticions del nou gen. La clau, segons Capecchi, consistia en descobrir les bases del mecanisme de recombinació homòloga. Suggeriments similars els havia fet Evans en un projecte de recerca que fou tombat pel UK Medical Research Council.

També a Cappecchi li tombaren el projecte de recerca sol·licitat. Passà a treballar amb una línia cel·lular transgènica a la qual s'havia incorporat un gen defectiu de resistència a la neomicina. Mitjançant la introducció de material genètic amb el gen correcte, Capecchi aconseguí que la línia cel·lular fos ressistent a la neomicina.

De mentres, Smithies pensava en la recombinació homòloga com una tècnica útil en la teràpia gènica anti-tumoral. El 1985 aconseguia una inserció dirigida a un gen concret en un cultiu de cèl·lules d'eritroleucèmia.

A partir de llavors arribà l'aplicació de la recombinació homòloga a cultius de cèl·lules mare embrionàries de ratolí. La resta ja és història.

Lligams:

Pàgina de Mario R. Capecchi al HHMI..

Pàgina de Martin J. Evans a la University of Cardiff..

Pàgina de Oliver Smithies a la University of North Carolina..

Gene modification in mice, text del Karolinska Institutet sobre el guardó d'enguany.

Aquesta entrada ha esta publicada en General. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

Modificacions específiques de gen (Capecchi, Evans i Smithies; Premi Nobel de Fisiologia-2007)

Genètica: Les primeres tècniques de transgènesi es basaren en la introducció de material genètic forani en un genoma (de bacteri, de planta, d'animal, etc.). La introducció, en aquest cas, es feia (i es fa) "a cegues". Hom suposa que el material genètic forani s'inserirà en un lloc més o menys adient. Si l'organisme transgènic així generat presenta la propietat nova que esperàvem, hom accepta el transgènic per bo. Mario R. Capecchi, Martin J. Evans, Oliver Smithies i d'altres obriren una nova via en la transgènesi en desenvolupar en el ratolí tècniques de modificació específiques de gens. Amb aquestes tècniques hom pot suprimir un gen en concret ("knock out"), o bé el pot substituir per un altre ("knock in") o, si li plau, pot fer que canvii el seu patró d'expressió ("knock off"). Aquestes tècniques s'han aplicat sobretot a la genòmica funcional (l'estudi del paper funcional individual dels gens) i a la recerca bàsica en general. Però de mica en mica també s'obren pas en l'obtenció de nous organismes modificats genèticament amb finalitats pràctiques. Avui s'ha sabut que Capecchi, Evans i Smithies rebran, a parts iguals, el Premi Nobel de Fisiologia o Medicina de l'any 2007.[@more@]

Mario R. Capecchi

Mario R. Capecchi (*Verona, 6.10.1937) va graduar-se en química i física a l'Antioch College (Ohio) el 1961. Es doctorà en biofísica a la Harvard University el 1967, sota la direcció de James D. Watson (*1928). La seva estada a Harvard es perllongà el 1973, quan passà a la University of Utah on ha desenvolupat la seva tasca investigadora i docent a través del "Capecchi lab". Des del 1988 el treball a Utah l'ha combinat amb la recerca al Howard Hughes Medical Institute (HHMI).

La recerca de Capecchi s'orienta cap a la genètica molecular del desenvolupament dels mamífers, és a dir a quin paper en concret juga tal o tal gen en tal o tal fase del desenvolupament embrionari. Ha publicat especialment en el camp de la genètica de la neurogènesi (formació del teixit nerviós i de les seves estructures), l'organogènesi (formació d'òrgans a partir de la imbricació de diferents teixits), la formació de la columna vertebral i de els extremitats, etc. Algunes de les soques de ratolins "knock out" generats per Capecchi i els seus col·laboradors també s'han emprat com a models de malalties tumorals i neuropsicològiques.

Martin J. Evans

Martin J. Evans (*Stroud, Gloucestershire, 1.1.1941) va graduar-se a Cambridge el 1963. Des d'un bon principi l'interessà l'estudi del control genètic del desenvolupament de vertebrats, i amb aquest pensament començà la tesi a l'University College de Londres. Mitjançant tècniques de separació electroforètica en gel d'agarosa i tècniques de marcatge radiactiu, Evans estudià els canvis en el perfil de l'ARN missatger durant la inducció neural de la rana Xenopus laevis. Però aplicar aquestes noves tècniques als models clàssics com el dels embrions de X. laevis era força ingrat. Això menà Evans a emprar com a model cultius cel·lulars procedents de teratocarcinomes de ratolí. Fou el primer en reeixir en el cultiu d'aquestes cèl·lules totipotencials (o cèl·lular mare). Amb la introducció d'aquestes cèl·lules totipotencials a embrions normals de ratolí obria una porta a l'obtenció d'adults "quimèrics".

El 1981, Evans i Matt Kaufman aconseguiren d'aïllar cèl·lules totipotencials d'un comportament similar a partir d'embrions normals. Aquestes cèl·lules, investigades al llarg dels projectes de recerca de Liz Robertson i Allan Bradley, rebrien finalment el nom de "cèl·lules mare embrionàries" ("embryonic stem cells"). Fou en aquestes cèl·lules mare embrionàries que fou possible l'obtenció dels primers ratolins "knock out" per a gens concrets.

Assolida la tècnica de "knock out" i les tècniques de "captura de gens" ("gene trap"), el grup d'Evans s'ha dedicat al desenvolupament de models animals de malalties humanes. Així hom ha treballat sobre el gen CFTC (el gen que es troba mutat en la fibrosi cística) i el gen BRCA2 (mutacions del qual són responsables d'alguns casos familiars de càncer de mama). El grup d'Evans també ha estat pioner en les tècniques de microarray, amb les quals hom pot resseguir simultàniament l'expressió de múltiples gens en una mateixa mostra biològica: què no hauria fet el jove Evans 45 anys abans si hagués disposat d'aquestes tècniques transcriptòmiques?

Oliver Smithies

Oliver Smithies (*Halifax, West Yorkshire, 23.7.1925) es va graduar en Fisiologia al Balliol College d'Oxford. Allà mateix va obtindre un mestratge en fisiologia (1951) i s'hi va doctorar en bioquímica (1951). Per treure endavant aquestes titulacions, Smithies fou un dels pioners de les tècniques d'electroforesi en gels. Aquestes tècniques consisteixen en la confecció de gels (d'agarosa, poliacrilamida, etc.), en un extrem dels quals hom hi col·loca, degudament processada, la mostra a analitzar. Seguidament hom col·loca el gel sota un camp elèctric: d'acord amb el pes molecular i la càrrega elèctrica, les diferents molècules de la mostra adoptaran una mobilitat diferenciada.

Anys més tard, ja als Estats Units, Oliver Smithies també seria un dels pioners en l'ús del fenomen de la recombinació homòloga per aconseguir una manipulació genètica dirigida i específica. La recombinació homòloga consisteix en el bescanvi d'informació de dues molècules d'ADN que comparteixen una seqüència més o menys idèntica. Si hom aconsegueix de recombinar una molècula d'ADN semi-artificial amb el genoma de cèl·lules mare embrionàries de ratolí pot aconseguir de blocar-hi ("knock out") un gen concret.

Modificacions específiques de gen a través de cèl·lules mare embrionàries de ratolí

L'Acadèmia de Ciències sueca ha triat aquests tres investigadors per premiar "les descobertes dels principis per la introducció de modificacions específiques de gens en ratolí mitjançant l'ús de cèl·lules mare embrionàries".

El jurat ha valorat la contribució fonamental d'Evans en la identificació i aïllament de cèl·lules mare embrionàries a partir d'embrions primerencs. Com hem dit va aconseguir de cultivar aquestes cèl·lules i de generar a partir d'elles embrions quimèrics que podien ser implantats en l'úter de ratolins. Les tècniques clàssiques de manipulació genètica (introducció aleatòria de material genètic) s'hi veien clarament afavorides, ja que la monitorització i selecció es podia fer a nivell de cultiu cel·lular i no d'embrió.

En el cas dels embrions de ratolí, en l'estadi de blàstula, hom pot aïllar cèl·lules totipotencials. Aquestes cèl·lules es poden mantenir indefinidament com a cultius cel·lulars i se les pot modificar genèticament. Les cèl·lules modificades es poden injectar a embrions normals. D'aquests embrions surten exemplars adults quimèrics. Mitjançant creuament hom pot arribar a aconseguir ratolins que presenten en tot l'organisme la modificació genètica induïda en el cultiu cel·lular.

Els grups de Capecchi i Smithies posaren la base per l'aplicació de la recombinació homòloga en les tècniques de modificació genètica. Amb aquestes tècniques hom podia dirigir la modificació a un gen concret per tal d'eliminar (noquejar-lo, i d'ací l'expressió "knock-out").

La recombinació homòloga havia estat descoberta originàriament en bacteris per Joshua Lederberg a mitjans del segle XX. En els anys 1970 hom mostrà que la recombinació homòloga és el mecanisme que subjau en la recombinació intracromosòmica que s'hi dóna en la formació de gàmetes (òvuls i espermatozoides). Gràcies a aquestes recombinació intracromosòmica, cadascun dels nostres cromosomes recull material genètic dels cromosomes patern i matern de cadascun dels nostres progenitors: sense ells, tots els cromosomes passarien de generació en generació intactes, tal com és el cas del cromosoma Y.

Dues estratègies per la modificació del material genètic d'una cel·lula. A la dreta tenim el procediment clàssic, basat en la inserció aleatòria del transgen. A l'esquerra es produeix una recombinació homòloga entre el transgen i el genoma cel·lular, com a conseqüència de la qual una part del trangen pot ésser-hi incorporada. Aquesta darrera tècnica és l'emprada en la "mutagènesi dirigida" que dóna lloc a ratolins "knock out" per un gen.

Richard Axel va mostrar que hom podia restaurar l'activitat timidina-cinasa de cultius cel·lulars que l'havien perdut genèticament si se'ls exposava al gen de timidina-cinasa herpesviral. Capecchi millorà el procés d'exposició a ADN forani mitjançant microinjeccions directes en el nucli cel·lular. Capecchi també mostra que el gen de la timidina-cinasa herpesviral tan sols s'introduïa en dos localitzacions concretes del genoma. El patró d'inserció mostrava sovint diverses repeticions del nou gen. La clau, segons Capecchi, consistia en descobrir les bases del mecanisme de recombinació homòloga. Suggeriments similars els havia fet Evans en un projecte de recerca que fou tombat pel UK Medical Research Council.

També a Cappecchi li tombaren el projecte de recerca sol·licitat. Passà a treballar amb una línia cel·lular transgènica a la qual s'havia incorporat un gen defectiu de resistència a la neomicina. Mitjançant la introducció de material genètic amb el gen correcte, Capecchi aconseguí que la línia cel·lular fos ressistent a la neomicina.

De mentres, Smithies pensava en la recombinació homòloga com una tècnica útil en la teràpia gènica anti-tumoral. El 1985 aconseguia una inserció dirigida a un gen concret en un cultiu de cèl·lules d'eritroleucèmia.

A partir de llavors arribà l'aplicació de la recombinació homòloga a cultius de cèl·lules mare embrionàries de ratolí. La resta ja és història.

Lligams:

Pàgina de Mario R. Capecchi al HHMI..

Pàgina de Martin J. Evans a la University of Cardiff..

Pàgina de Oliver Smithies a la University of North Carolina..

Gene modification in mice, text del Karolinska Institutet sobre el guardó d'enguany.

Aquesta entrada ha esta publicada en General. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *