Les fosfatases en el control de la proliferació cel·lular

Biologia molecular: Bona part del coneixement que tenim sobre les bases moleculars de la biologia cel•lular l’hem adquirit en projectes de recerca finançats amb la lluita contra el càncer com a objectiu. El retorn d’aquest coneixement s’ha plasmat, en les darreres dècades, en les eines diagnòstiques, però progressivament també es deixa veure, ni que sigui modestament, en el camp terapèutic. La descoberta de les mutacions responsables de la transformació tumoral han posat de manifest el funcionament normal (i el funcionament patològic) del cicle cel•lular: primera fase de creixement (G1), fase de duplicació genètica (S), segona fase de creixement (G2), divisió cel•lular (M). També s’han conegut les vies de senyalització que regulen el trànsit per aquestes fases (i, també, l’entrada en la fase de quiescència o G0). Les vies de senyalització connecten la membrana cel•lular (porta d’entrada de les informacions extracel•lulars) amb el nucli cel•lular (regulant l’expressió dels gens) i amb els orgànuls citoplasmàtics. La immensa majoria dels components d’aquestes vies de senyalització són proteïnes. L’activació/inactivació d’aquestes proteïnes de senyalització es realitza de diferents formes, però destaca la fosforilació, és a dir l’addició de grups fosfats en determinats punts de les proteïnes (residus de serina o treonina, o residus de tirosina). Així, una proteïna A fosforila una proteïna B, la qual cosa activa la proteïna B, que passa a fosforilar una proteïna B. En general, les fosforilacions són activadores (promouen una activitat enzimàtica), però també n’hi ha d’inhibidores. La fosforilació de proteïnes les fan les proteïn-cinases. Les proteïn-cinases formen part del proteoma (conjunt de proteïnes), però amb prou distintivitat perquè hom parli d’un cinoma (conjunt de proteïnes amb activitat proteïn-cinasa). Perquè el mecanisme fosforilador sigui efectiu, és clar, cal que hi hagi unes proteïnes defosforiladores. És el rol de les proteïn-fosfatases, també part del proteoma i que, considerades globalment, constitueixen el fosfatoma. En els anys 1980 i 1990, hom posava especial èmfasi en les proteïn-cinases i proteïn-fosfatases individuals. El paradigma era que alguns punts de la xarxa de senyalització cel•lular eren els nodes que explicaven la transformació tumoral i contra els quals, en conseqüència, calia adreçar els esforços de desenvolupament de fàrmacs. Aquest paradigma és encara vigent en bona mesura en l’àmbit del desenvolupament terapèutic, però en la biologia cel•lular ha guanyat pes un coneixement més integral. Aquest coneixement integral és l’objectiu de la revista Molecular Systems Biology. Ahir publicaven en-línia un exemple d’aquesta biologia sistèmica molecular, en forma d’un article titular “Cartografia del fosfatoma humà en les vies de senyalització del creixement”.

Principals vies de transducció de senyals. Els senyals decideixen el destí de la cèl•lula: des de l’apoptosi fins a la proliferació cel•lular.

La línia de recerca de Francesca Sacco i Gianni Cesareni

L’article explica la recerca realitzada per part del Grup de Recerca de Genètica Molecular del Departament de Biologia de la Universitat de Roma ‘Tor Vergata’. En aquest departament, Gianni Cesareni és professor titular de genètica molecular. Cesareni és físic de formació (es va graduar a La Sapienza), i s’introduí en el camp de la biologia molecular de la mà de Sidney Brenner en fer una estada de tres anys a Cambridge. Brenner, en aquells anys, començava a considerar esgotada la fase clàssica de la genètica molecular. De totes formes, Cesareni, en deixar Cambridge, passà a l’EMBL de Heidelberg, on formà un grup de recerca precisament dedicat a una qüestió clàssica: la del control de la replicació dels plàmids (minicromosomes) bacterians. En el 1989, tornà a Roma. Amb els anys les eines per fer una biologia sistèmica s’han fet més abastables. Així naixia el projecte de recerca en xarxes d’interacció de proteïnes, que combina la proteòmica d’alt rendiment (en la qual s’estudien simultàniament totes les proteïnes d’una mostra), la bioinformàtica i la realització d’experiments biològics (per exemple, l’estudi de la internalització del receptors EGF en cultius de cèl•lules animals en resposta a estímuls externs o a modulacions de les vies de senyalització cel•lular). Cesareni també és membre de la IRCCS Fondazione Santa Lucia. Des de fa uns anys, un dels esforços del grup és l’estudi del fosfatoma humà (és a dir del conjunt de proteïn-fosfatases del proteoma humà) i, en particular, com actuen en la regulació del creixement cel•lular. En aquesta recerca, han participat altres membres del grup com Francesca Sacco, Pier Federico Gherardini, Serena Paoluzi i Manuela Helmer-Citterich. També signa l’article Luisa Castagnoli, professora titular de genètica. Els reptes tècnics s’han resol amb la col•laboració de Julio Saez-Rodriguez, de l’EMBL-EBI de Hinxton. Antonella Ragnini-Wilson, des de les instal•lacions de microscopia d’alt rendiment del Departament de Farmacologia Traduccional i Cel•lular, del Consorzio Mario Negri Sud, també hi ha contribuït.

Les tècniques d’alt rendiment en biologia cel•lular requereixen l’ús simultani de milers de microcultius. Les cèl•lules HeLa, per la seva gran plasticitat, han estat elegides com a model en els estudis de Cesareni. Sempre queda la qüestió de si són poc o molt representatives del que s’esdevé en els diferents tipus cel•lulars epitelials del cos humà.

L’impacte de la repressió de 298 gens del fosfatoma humà

La microscopia automatitzada d’alt rendiment és necessària per veure l’efecte en el creixement de cultius cel•lulars d’alteracions en cadascun de 298 gens vinculats directament o indirecta a les proteïn-fosfatases humanes (tant gens de proteïn-fosfataes com de subunitats reguladores de fosfatases). L’ús de la tècnica d’ARNsi (petites molècules d’ARN amb una seqüència interferidora) permet el silenciament individual d’un gen en aquests cultius cel•lulars. Els autors han triat com a model les cèl•lules HeLa, una línia cel•lular immortalitzada procedent d’un càncer epitelial.

Per cadascun dels 298 gens, es dissenyaren tres molècules diferents d’ARNsi. Per a cada cas, s’estudià mitjançant tècniques immunològiques l’impacte del silenciament en quatre indicadors de creixement cel•lular:
– la translocació nuclear del NFκB. Això s’estudiava en cèl•lules a les 48h de la recepció de l’ARNsi, i exposades durant els darrers 10 min al TNFα.
– la fosforilació i activació d’ERK (en aquest cas, no cal l’exposició al TNFα).
– la fosforilació i activació de p38, en condicions iguals a l’NFκB.
– la fosforilació i activació de rpS6.

El principal indicador microscòpic emprat fou la formulació d’autofagosomes (detectats com a través de l’aparició de taques positives per a la proteïna LC3).

Dels 298 gens estudiats, un total de 76 van donar positiu en tots cinc indicadors (els quatre indicadors moleculars i el microscòpic), és a dir un 30% del fosfatoma humà. D’aquests 76 gens, un 63% contenen un domini catalític fosfatasa, un 20% contenen una subunitat reguladora i un 17% són lípids-fosfatases. Els autors descartaren el tercer grup.

El dibuix de la xarxa del fosfatoma humà

El buidatge de la ingent literatura sobre fosfatases, combinat amb la realització d’experiment, ha permès al grup d’oferir la xarxa de senyalització de les proteïn-fosfatases i proteïnes i gens vinculats.

En aquest punt, les eines bioinformàtiques són imprescindibles. El programari utilitzat és el CellNetOptimizer, que modelitza quantitativament les vies de senyalització cel•lular.

Comparant el mapa de la literatura amb els efectes del silenciament

A partir de la xarxa teòrica de relacions entre les fosfatases, es poden fer prediccions lògiques sobre l’efecte que tindria inhibir-ne cadascuna d’elles. Ara bé, això cal contrastar-ho amb els efectes que té la inhibició sobre el creixement cel•lular observat al microscopi.

En aquesta fase, hom modula el creixement cel•lular amb sèrum o amb TNFα, o amb inhibidors de MEK, p38, PI3K o mTOR, i s’observa l’efecte en cadascuna de les fosfatases seleccionades en els experiments anteriors.

Així, de les 58 fosfatases analitzades, unes 35 mostren el mateix efecte en el model teòric que en l’experimentació.

Un mapa de dos terços de les proteïn-fosfatases

En general, la idea clàssica és que les proteïn-cinases estimulen el creixement, i les proteïn-fosfatases l’inhibeixen. És cert que moltes proteïn-cinases han estat identificades com a oncogens, i que unes quantes proteïn-fosfatases han estat reconegudes com a gens supressors de tumors. En el mapa de Sacco et al., el 60% de les proteïn-fosfatases tenen un efecte supressor de la senyalització cel•lular, amb la qual cosa aquesta noció general es revela com a incompleta.

El mapa de Sacco et al., sens dubte, mostra que no totes les proteïn-fosfatases tenen la mateixa rellevància en la senyalització cel•lular. Hi ha nodes més importants que uns altres. Ajuda, doncs, en el moment de definir de forma més contundent les dianes terapèutiques en el disseny de nous fàrmacs contra carcinomes.

En total, amb el mapa s’han identificat 41 fosfatases que tenen un paper rellevant en el creixement de cèl•lules epitelials humanes. Aproximadament, el mapa de Sacco et al. contempla un 67% de totes les proteïn-fosfatases implicades en el creixement cel•lular. No és un mapa global en aquest sentit. Tampoc no ho és, en tant que s’orienta a l’anàlisi del creixement cel•lular, a com les proteïn-fosfatases influeixen en la progressió al llarg del cicle cel•lular. Però, segons els autors, aquesta estratègia té un caràcter general, aplicable a altres situacions i a altres segments del proteoma humà.

Aquesta entrada ha esta publicada en 3. La Vida. Afegeix a les adreces d'interès l'enllaç permanent.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *

Aquest lloc utilitza Akismet per reduir el correu brossa. Aprendre com la informació del vostre comentari és processada